銀杏黃酮對酒精性氧化損傷的保護作用及其機制的研究.pdf

1、近年來人們興奮地發(fā)現(xiàn)，一些天然的黃酮類或多酚類抗氧化劑，如姜黃素、槲皮素、銀杏黃酮等可誘導HO-1表達，并由此展示出協(xié)同而增強的抗氧化效應和更為廣泛的藥理活性。有鑒如此，本研究以具有優(yōu)良抗氧化和護肝效應的銀杏黃酮作為干預物，采用酶學與生化分析、RT-PCR、流式細胞術、WesternBlot、病理及超微病理等研究手段，通過動物試驗，系統(tǒng)探討急、慢性酒精暴露及銀杏黃酮干預對血清和肝、心、腎、睪丸抗氧化系統(tǒng)及血清脂質水平的影響，在此基礎上，

2、以肝損傷為重點，進一步研究長期酒精攝入與不同劑量銀杏黃酮干預對肝臟結構與功能、線粒體與微粒體抗氧化系統(tǒng)以及HO-1mRNA、蛋白表達與酶活性(HO-1及CYP2E1)水平的影響，主要內(nèi)容如下： 第一部分:銀杏黃酮對小鼠急性酒精暴露后抗氧化系統(tǒng)的保護作用 盡管對酒精性損傷的氧化應激機制已開展了大量研究，但基于生物體的復雜性，乙醇攝入對機體抗氧化系統(tǒng)的具體影響至今報道不一。因此，本部分采用酶學與生化分析手段，探討小鼠急性酒精

3、暴露及銀杏黃酮干預后血清與肝臟抗氧化系統(tǒng)的變化，以探尋相應的時間-效應關系。 實驗結果顯示：小鼠急性酒精暴露(4.8g/kg)后1～15h內(nèi)，血清與肝臟GSH水平與抗氧化酶活性呈“U”形變化，而MDA水平呈明顯的倒“U”形變化，且恢復較慢。其中血清GSH水平與SOD活性在2h降至最低，GSH-Px活性4h最低，降低幅度分別為23.5％、20.3％和20.2％，MDA水平4h最高(升幅32.4％)；肝臟GSH水平與GSH-Px、S

4、OD活性在4h降至最低，降低幅度分別為29.3％、18.4％和23.6％，而MDA水平在6h升至最高(升幅27.5％)。預先經(jīng)銀杏黃酮(96mg/kg)干預，可增強機體在急性乙醇暴露初期的代償反應，減輕小鼠酒精攝入所致的GSH消耗、抗氧化酶失活和脂質過氧化，促使受損的抗氧化系統(tǒng)盡快恢復。 以上結果表明，小鼠急性酒精暴露后2～6h，尤其是4h，可明顯影響到血清與肝臟的抗氧化水平，而銀杏黃酮干預可在一定程度上緩解這種影響而表現(xiàn)出良好

5、的保護效應。 第二部分:大鼠酒精攝入后血清抗氧化系統(tǒng)與脂質水平的動態(tài)變化及銀杏黃酮的保護效應 流行病學調查資料顯示，飲酒量不同，心血管疾病與糖尿病的發(fā)生風險也各異，提示不同水平的酒精攝入可能對機體健康有不同的影響。因此，本部分以大鼠為研究對象，探討不同劑量的酒精持續(xù)攝入不同時間后，血清抗氧化水平與脂質水平的動態(tài)變化，在此基礎上，研究不同劑量的黃酮干預對不利變化的影響。 實驗結果顯示：大鼠攝入低劑量的酒精(0.8g

6、/kg)30、60、90天后，血清GSH、MDA、TG與TC水平無明顯變化，但SOD、CAT與GSH-Px活性則不斷升高，HDL-C在90天明顯升高；大鼠攝入中劑量的酒精(1.6g/kg)30、60、90天后，血清GSH水平逐漸下降，SOD與GSH-Px活性先升高后下降，CAT活性與MDA、TG、TC水平則持續(xù)升高，HDL-C輕微升高后逐漸回落；大鼠攝入高劑量的酒精(2.4g/kg)30、60、90天后，血清GSH與HDL-C水平及SO

7、D、GSH-Px活性不斷下降，CAT活性輕微升高后明顯下降，而MDA、TG、TC水平不斷上升。對高劑量酒精攝入大鼠進行銀杏黃酮(48及96mg/kg)干預，尤其高劑量(96mg/kg)干預，在不同時間均可部分抑制或降低酒精所致的抗氧化酶失活程度、GSH與HDL-C水平的下降及TG、TC與MDA水平的上升幅度，緩解高劑量酒精攝入對血清脂質水平及抗氧化系統(tǒng)的影響。 以上結果表明，低劑量酒精攝入，可在一定程度上激活機體的抗氧化系統(tǒng)和升

8、高HDL-C水平，從而產(chǎn)生相應的保護效應；中劑量的酒精攝入，尤其是長時間攝入后，血清脂質水平及過氧化程度不斷升高，抗氧化水平總體呈先輕微升高后明顯下降的趨勢，氧化應激不斷累積和加重；高劑量酒精攝入則進一步加重機體的氧化應激和脂質代謝紊亂程度。對高劑量酒精攝入大鼠進行銀杏黃酮干預，尤其是高劑量銀杏黃酮干預，可以緩解酒精的影響，顯示出明顯的調節(jié)血脂和拮抗酒精性氧化應激的作用。 笫三部分:長期酒精攝入對大鼠組織抗氧化系統(tǒng)的影響及銀杏黃

9、酮的干預作用 長期嗜酒不僅嚴重影響到肝功能，還可誘發(fā)心肌受損、腎功能不全、睪丸生精異常等多器官的病變和損傷。乙醇的高度彌散性及在代謝過程中產(chǎn)生過量的自由基與活性氧，繼而引起多組織的氧化損傷，是酒精相關性疾病的重要發(fā)病機制。因此，本部分在觀察長期高劑量的酒精攝入對肝、心、腎、睪丸抗氧化系統(tǒng)影響的基礎上，進一步探討銀杏黃酮干預對酒精誘導的多組織氧化損傷的保護作用。 實驗結果顯示：大鼠攝入高劑量酒精(2.4g/kg)90天后，

10、除腎SOD及心CAT活性無明顯變化外，肝、心、腎、睪丸GSH水平、抗氧化酶活性及總抗氧化能力明顯下降，而MDA與ROS水平明顯升高。經(jīng)不同劑量的銀杏黃酮干預(48及96mg/kg)，尤其是高劑量(96mg/kg)干預，可明顯減輕或部分抑制因酒精染毒所致的GSH消耗、抗氧化酶失活及總抗氧化能力下降，降低ROS的產(chǎn)生水平和脂質過氧化程度，從而在一定程度上緩解了酒精對肝、心、腎、睪丸抗氧化系統(tǒng)的影響。 以上結果表明，長期高劑量的酒精攝

11、入可導致肝、心、腎、睪丸多器官的氧化-抗氧化失衡，而銀杏黃酮干預，尤其是高劑量銀杏黃酮干預，可以減輕或抑制酒精對多器官抗氧化系統(tǒng)的影響，對多組織酒精性氧化應激具有良好的保護作用。 第四部分:銀杏黃酮防御酒精性肝損傷相關機制的研究 肝臟是酒精吸收后代謝的主要場所，也是酒精中毒的主要靶器官。本部分采用酶學與生化分析手段，并借助于RT-PCR、流式細胞術、WesternBlot及超微病理等方法，進一步探討高劑量酒精攝入后，大鼠

12、肝臟結構與功能、肝線粒體與微粒體氧化-抗氧化系統(tǒng)、CYP2E1活性及肝HO-1表達與酶活性的變化，在此基礎上，研究不同劑量銀杏黃酮的干預效果及相關機制。 實驗結果顯示：長期的酒精攝入(2.4g/kg，90天)導致肝細胞嚴重脂變性、濁腫和水變性，肝功能異常，線粒體、微粒體出現(xiàn)明顯的腫脹、變形與退化等病理性改變，氧化-抗氧化失衡，CYP2E1活性升高近4倍，而HO-1mRNA、蛋白表達及酶活性水平分別下降55.0％、49.3％和45

13、.5％；銀杏黃酮(48及96mg/kg)干預，尤其高劑量(96mg/kg)干預，可明顯減輕乙醇所致的病理性改變和線粒體及微粒體的氧化損傷，抑制CYP2E1的活化，并在mRNA、蛋白與酶活性水平對HO-1具有明顯的誘導作用，而對其它抗氧化蛋白無明顯激活作用。 以上結果表明，長期的酒精攝入削弱了肝細胞線粒體與微粒體抗氧化水平，抑制了HO-1的表達與活性；銀杏黃酮可能通過對HO-1的誘導而展示出協(xié)同和增強的抗氧化效應，從而更有效清除乙

14、醇代謝過程中形成的大量ROS，保護機體的抗氧化系統(tǒng)，減輕乙醇所致的細胞和細胞器結構改變與功能損傷。 綜上所述，低劑量的酒精攝入，可能通過抗氧化系統(tǒng)的代償性活化和HDL-C水平的升高而發(fā)揮協(xié)同的保護作用，但過量(尤其是長期過量)的酒精攝入，可導致嚴重的脂質代謝紊亂和多組織的氧化損傷。而銀杏黃酮干預可以明顯減輕酒精對機體脂質代謝和抗氧化系統(tǒng)的不利影響，降低肝臟等多組織的氧化應激程度，銀杏黃酮對HO-1的誘導可能介導了其拮抗酒精性氧化

15、應激的作用。當然，HO-1的介導作用有待在細胞水平利用HO-1特異性的抑制劑與誘導劑加以進一步證實。此外，銀杏黃酮對HO-1誘導的信號通路，以及HO-1介導的保護效應究竟是對底物的及時清除，還是某種代謝產(chǎn)物的作用，亦或是綜合作用的結果還有待進一步深入研究。創(chuàng)新點： 1)一般認為適量飲酒對機體的健康效應可能與HDL-C有關，本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化系統(tǒng)代償性活化可能也參與了這種保護作用。 2)長期過量的酒精攝入使機體逐步失代償而導