乙酸脅迫耐性基因挖掘及高活性釀酒酵母構(gòu)建.pdf

1、釀酒酵母對(duì)環(huán)境脅迫耐受性是其工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的重要性能之一。良好的耐性可保持較好發(fā)酵活性，并促進(jìn)細(xì)胞回用，因此，研究釀酒酵母對(duì)多種環(huán)境脅迫因素的耐性機(jī)理，進(jìn)一步選育耐性良好的菌株，對(duì)提高釀酒酵母在生物燃料、食品及精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。此外，乙酸是木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理過程產(chǎn)生的主要抑制性物質(zhì)，高濃度乙酸對(duì)釀酒酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)酵具有強(qiáng)烈抑制作用，成為制約纖維素乙醇高效生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。因此，提高釀酒酵母的乙酸脅迫耐受性對(duì)提高纖

2、維素乙醇發(fā)酵效率至關(guān)重要。
　　本課題組前期研究表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中適量添加硫酸鋅可以顯著提高釀酒酵母的乙酸脅迫耐受性。為了深入探究硫酸鋅添加提高乙酸脅迫耐受性的分子機(jī)理，挖掘與乙酸脅迫耐性相關(guān)的新功能基因，本文對(duì)乙酸脅迫條件下實(shí)驗(yàn)組（添加硫酸鋅）和對(duì)照組（未添加硫酸鋅）細(xì)胞進(jìn)行了代謝物譜測(cè)定和全局轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明，添加硫酸鋅影響了細(xì)胞膜及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，如負(fù)責(zé)編碼羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因ADY2、ATO2和JEN1在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中顯

3、著下調(diào)。此外，添加硫酸鋅也影響了中心碳代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝的中間代謝物含量以及相關(guān)基因表達(dá)量，如6-磷酸葡萄糖、丙氨酸和還原型谷胱甘肽等物質(zhì)含量增加，參與嘌呤代謝調(diào)控的基因ADE1、ADE13和ADE17顯著上調(diào)等。添加硫酸鋅還影響了胞內(nèi)鋅指蛋白編碼基因的表達(dá)量，如PPR1和SET5，這些基因可能在全局調(diào)控水平上影響細(xì)胞代謝。根據(jù)組學(xué)分析數(shù)據(jù)，分別選擇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘌呤代謝及調(diào)控基因作為可能的關(guān)鍵基因，研究了這些相關(guān)基因?qū)︶劸平湍敢?/p>

4、酸耐受性的影響。
　　首先發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中敲除ADY2提高了菌株在乙酸、過氧化氫和甲酸脅迫條件下的生長(zhǎng)性能，其最大比生長(zhǎng)速率比對(duì)照菌株分別提高了39.55％、23.41％和15.86％，但是在無脅迫條件下生長(zhǎng)和對(duì)照無顯著差別。AD Y2敲除突變體BYady2在3.6 g/L乙酸和混合抑制物（5.3 g/L乙酸、1.3 g/L糠醛和0.5 g/L苯酚）條件下的發(fā)酵效率顯著高于對(duì)照菌株BY4741，其乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了14.66

5、％和4.64％。同時(shí)在工業(yè)釀酒酵母Sc4126中敲除ADY2也有類似效果。深入研究發(fā)現(xiàn)，作為乙酸進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Ady2p編碼基因的敲除降低了胞內(nèi)乙酸含量，其由對(duì)照菌株的0.39 g/g DCW降低到0.34g/g DCW，同時(shí)還提高了細(xì)胞膜完整性，從而提高菌株的乙酸耐受性。
　　其次，過表達(dá)嘌呤代謝關(guān)鍵基因ADE1，ADE13和ADE17提高了酵母菌株在乙酸和過氧化氫脅迫條件下的生長(zhǎng)性能。在5 g/L乙酸脅迫條件下過表達(dá)菌株

6、BADE1，BADE13和BADE17在35h內(nèi)都可結(jié)束發(fā)酵，而此時(shí)對(duì)照菌株中仍有3.95 g/L的殘?zhí)?，其中菌株BADE17的發(fā)酵性能最好，其在23 h便可結(jié)束發(fā)酵。在含有抑制物的模擬水解液中，過表達(dá)菌株BADE1，BADE13和BADE17發(fā)酵效率也比對(duì)照有所提高。探究機(jī)理發(fā)現(xiàn)，ADE1，ADE13和ADE17過表達(dá)可提高胞內(nèi)ATP含量以及抗氧化物酶SOD的活性，另外ADE17過表達(dá)還使胞內(nèi)GSH含量提高了105.94％，因此嘌呤代

7、謝三個(gè)關(guān)鍵基因過表達(dá)促進(jìn)了ROS的清除，提高了細(xì)胞活性。
　　另外，PPR1和SET5過表達(dá)菌株BPPR1和BSET5在乙酸、過氧化氫和高溫脅迫條件下的生長(zhǎng)性能好于對(duì)照菌株，且在乙酸脅迫條件下的發(fā)酵效率高于對(duì)照菌株。在玉米秸稈水解液中PPR1和SET5過表達(dá)使得乙醇的生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了18.41％和18.34％。對(duì)過表達(dá)菌株進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PPR1和SET5增加了胞內(nèi)能量供應(yīng)，提升了胞內(nèi)抗氧化酶活性，同時(shí)還上調(diào)了脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)

8、錄因子編碼基因HAA1，YAP1和MSN4的相對(duì)表達(dá)量，從而從多角度調(diào)控賦予細(xì)胞耐受性提高的性能。
　　Set5p是釀酒酵母組蛋白H4甲基化酶，但對(duì)其鋅指結(jié)構(gòu)的作用目前尚未見報(bào)道。本文對(duì)Set5p鋅指結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，研究其對(duì)Set5p功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋅指結(jié)構(gòu)域的缺失降低了細(xì)胞在乙酸脅迫和氧化脅迫條件下的生長(zhǎng)性能，其生長(zhǎng)速率分別比對(duì)照菌株的降低了42.53％和35.02％，提示鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)et5p蛋白提高乙酸脅迫耐性和氧化脅迫

9、耐性具有重要影響。
　　最后，利用iTRAQ技術(shù)檢測(cè)了乙酸脅迫條件下Set5p過表達(dá)對(duì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)467個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)的有380個(gè)，下調(diào)的有87個(gè)。功能聚類分析后發(fā)現(xiàn)，SET5過表達(dá)提高了糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)量，從而有利于乙醇的生產(chǎn)和為提高脅迫耐性提供能量。同時(shí)，還提高M(jìn)APK途徑和TOR/RAS途徑蛋白的表達(dá)，進(jìn)而有利于細(xì)胞對(duì)乙酸脅迫、氧化脅迫、滲透脅迫和饑餓脅迫的積極響應(yīng)。此