弓形蟲NTPase基因的克隆、表達(dá)與鑒定及其融合蛋白免疫保護(hù)機(jī)制的初探.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種全球分布的機(jī)會(huì)致病性原蟲，可在人和動(dòng)物的所有有核細(xì)胞內(nèi)寄生和繁殖，引起人畜共患的弓形蟲病，孕婦及免疫缺陷的患者輕度感染即可引起嚴(yán)重的后果。目前在弓形蟲病的免疫研究方面，國內(nèi)外學(xué)者大都致力于尋找和開發(fā)能有效刺激宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答、抵御弓形蟲感染的候選抗原。三磷酸核苷水解酶(nucleosidetriphosphatehydrolase，NTPase)為分布于弓形蟲速殖子表面的一種主要

2、特異性抗原，對(duì)蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的寄生和繁殖都具有重要的作用，本研究將對(duì)NTPase在免疫學(xué)方面的應(yīng)用進(jìn)行初步的探討。 目的： 1.構(gòu)建高效原核表達(dá)載體pBAD-HisB-NTPase，采用組氨酸標(biāo)簽融合表達(dá)NTPase蛋白，經(jīng)純化復(fù)性后，對(duì)其生物學(xué)活性及免疫學(xué)活性進(jìn)行鑒定； 2.NTPase融合蛋白免疫小鼠后，觀察并研究其免疫保護(hù)性。 方法： 1.NTPase基因的克隆與表達(dá)采用PCR方法擴(kuò)增剛地

3、弓形蟲RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-TEasy載體，經(jīng)酶切與測(cè)序鑒定后亞克隆至表達(dá)質(zhì)粒pBAD-HisB，并轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。 2.重組NTPase融合蛋白的純化及鑒定使用Ni離子親和層析柱純化重組質(zhì)粒pBAD-HisB-NTPase表達(dá)產(chǎn)生的含組氨酸的重組蛋白，SDS-PAGE鑒定其純度。對(duì)純化蛋白進(jìn)行透析復(fù)性后，Bradford法測(cè)定其濃度，孔雀綠鉬酸銨法檢測(cè)復(fù)性蛋白的ATPase

4、活性，并使用Westernblotting和間接ELISA鑒定重組蛋白的免疫學(xué)活性。 3.重組蛋白的免疫保護(hù)研究重組NTPase蛋白和PBS分別免疫BALB/c小鼠，通過比較兩組血清中的抗體生成量觀察重組蛋白的體液免疫水平。使用間接ELISA檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的細(xì)胞因子的含量，結(jié)合CCK-8法檢測(cè)的淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果研究重組蛋白的細(xì)胞免疫水平。 結(jié)果： 1.PCR擴(kuò)增得到特異的剛地弓形蟲NTPase-Ⅱ基因

5、序列，經(jīng)測(cè)序鑒定無基因突蠻。 2.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pBAD-HisB-NTPase，SDS-PAGE結(jié)果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coliBL21(DE3)中獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要存在于包涵體中。融合蛋白的相對(duì)分子量(Mr)約70000，與理論值相近。經(jīng)Ni2+-NTA樹脂純化后純度約為84％。 3.復(fù)性蛋白經(jīng)孔雀綠鉬酸銨法測(cè)定具有良好的ATPase活性。Westernblotting和ELISA結(jié)果顯示，純

6、化的重組蛋白可被弓形蟲感染的鼠血清及鼠抗重組蛋白血清特異性識(shí)別，具有良好的免疫反應(yīng)性和免疫原性。 4.初步建立了用表達(dá)的重組NTPase-Ⅱ蛋白檢測(cè)弓形蟲感染血清的間接ELISA方法。 5.重組NTPase蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了弓形蟲NTPase基因的高效原核表達(dá)載體，所表達(dá)的融合蛋白具有良好的生物學(xué)活性和免疫學(xué)活性，作為弓形蟲感染免疫診斷試劑盒的診