內源性醛類代謝失調致認知損傷的機制研究.pdf

1、背景：
　　內源性醛類（甲醛、核糖）在機體內維持一定的生理濃度且具有重要的生理功能。內源性甲醛作為甲基供體，參與體內葉酸循環(huán)、DNA甲基化、表觀遺傳學修飾、細胞分化、基因表達調控等多種細胞生物學過程。內源性核糖參與體內能量提供物質-三磷酸腺苷（ATP）的合成，同時也是 DNA和 RNA的重要組成部分。當體內內源性甲醛、核糖代謝失調，會造成機體認知功能損傷。已有實驗結果顯示，隨著老齡化年齡的增加，體內甲醛逐漸升高。阿爾茲海默病病人體

2、內甲醛與認知損傷呈正相關。甲醛能導致細胞凋亡、認知功能損傷。然而，關于低濃度甲醛長時間處理神經細胞是否會導致細胞功能損傷，形態(tài)改變尚未見文獻報道。眾所周知，II型糖尿病病人體內葡萄糖含量增加，但已有實驗結果顯示II型糖尿病病人體內的核糖含量同樣顯著增加，并且核糖與蛋白質發(fā)生非酶促糖基化反應的速度顯著快于葡萄糖，產生的糖基化產物（AGEs）具有更強的細胞毒性。胰島素可以改善學習、認知損傷，但胰島素能否能挽回核糖產生的糖基化終末產物造成的神

3、經細胞毒性、認知功能損傷尚不可知。
　　目的：
　　探討低濃度甲醛長時間處理神經細胞是否會出現(xiàn)形態(tài)改變、功能損傷。繼而研究阿爾茲海默病致病機制并對其早期預防、診斷、治療提供理論依據。探討胰島素是否能挽回核糖代謝失調導致的細胞毒性、認知功能損傷及可能的作用機制。
　　方法：
　　運用連續(xù)傳代的方法，建立甲醛導致神經系統(tǒng)的慢性損傷模型，全息激光成像系統(tǒng)，觀察細胞體積、面積、厚度、粗糙度、橢圓度等形態(tài)變化以及貼壁情況。

4、激光共聚焦顯微鏡觀察甲醛處理原代神經元后其樹突、軸突數(shù)目、長度、復雜度的變化。運用小鼠神經母瘤細胞（N2a）建立核糖細胞毒性損傷模型，CCK-8檢測細胞活力，結晶紫染色檢測細胞數(shù)目，全息激光成像系統(tǒng)檢測細胞形態(tài)變化，Western blotting檢測不同處理組細胞內糖基化終末產物、胰島素受體、胰島素受體磷酸化水平以及 GRP78蛋白表達變化，細胞免疫熒光檢測細胞內AGEs定位以及表達變化，ThT染色檢測細胞內纖維纏結變化。高效液相色譜

5、檢測細胞培養(yǎng)基內的核糖含量。免疫共沉淀檢測細胞內胰島素受體與糖基化終末產物（AGEs）是否有相互作用。采用腹腔注射核糖，建立核糖導致認知功能損傷動物模型。拉力檢測小鼠前肢力量，水迷宮、Y迷宮檢測小鼠學習記憶能力，轉棒實驗檢測小鼠平衡能力。Western blotting、免疫組化檢測各組織內糖基化終末產物、胰島素受體、磷酸化胰島素受體、組織蛋白酶-D表達變化。
　　結果：
　　病理濃度甲醛長時間處理神經細胞，會導致細胞變厚、

6、變圓，貼壁能力減弱。同時使神經元突起的一級結構減少，神經連接減少。核糖處理細胞，細胞活力隨核糖處理的濃度增加顯著的下降，細胞的的糖基化終末產物(AGEs)增加。胰島素通過激活胰島素受體，使胰島素受體磷酸化增加，繼而激活細胞內清除AGEs的途徑，從而挽回核糖處理24h產生的細胞毒性，使細胞活力增加、細胞形態(tài)改變，細胞內AGEs表達量顯著下降。相同濃度的葡萄糖處理細胞，細胞活力與對照組比較無明顯變化，胞內AGEs也無變化。長時間注射，小鼠的

7、體重增加，但各處理組小鼠增加的速度低于對照組。在第32天，核糖處理組、核糖加胰島素處理小鼠體重顯著低于對照組。腹腔注射會使小鼠的前肢拉力逐漸下降，核糖處理組小鼠下降的速度高于對照組和其他實驗處理組，并在第20天時與對照組存在顯著差異，但結束給藥后，各處理組小鼠的前肢拉力恢復到最初狀態(tài)，核糖處理組小鼠上升最慢。腹腔注射實際對小鼠存在一種損傷，影響小鼠的肌肉能力。各處理組血糖無明顯變化。運用水迷宮、Y迷宮檢測各處理組小鼠的學習記憶能力。水迷

8、宮結果顯示核糖處理小鼠，小鼠的學習能力增加，但隨后的檢測結果顯示核糖處理組小鼠的空間記憶能力損傷。Y迷宮結果提示核糖處理組，小鼠的工作記憶與對照組相比有損傷，與核糖加胰島素處理組的記憶能力比存在顯著差異。運用轉棒實驗排除運動的因素的影響。轉棒實驗結果顯示，核糖處理組小鼠的耐力、平衡能力與對照組沒有變化，但與胰島素組、核糖加胰島素處理組存在顯著差異。蛋白免疫印跡檢測了各處理組血清中蛋白以及糖基化終末產物的量，實驗結果顯示，核糖處理組小鼠血