松褐天牛氣味結合蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、松褐天牛Monochamus alternatus Hope是松材線蟲病的主要傳播媒介，控制松褐天牛是有效治理松材線蟲病的方法。氣味結合蛋白(OBPs)是氣味分子與氣味受體之間的媒介，在昆蟲識別信息化學物質的過程中起著重要的作用，但松褐天牛氣味結合蛋白的具體功能仍不明確。為明確MaltOBPs在松褐天牛嗅覺感受中的功能及篩選松褐天牛行為活性物質提供基礎，我們構建了松褐天牛觸角轉錄組，篩選并克隆5個MaltOBPs基因，分析了5個Malt

2、OBPs基因的時空表達與行為的相關性，測定了重組MaltOBPs與18種寄主植物揮發(fā)物的熒光結合特性及與pH值的相關性。主要取得如下研究結果:
　　1.松褐天牛觸角轉錄組的構建
　　選取松褐天牛雌雄蟲成蟲觸角構建了松褐天牛觸角轉錄組。經(jīng)過測序、原始序列處理、聚類和拼接共獲得85，869條contigs序列，平均長度為297bp;獲得37，242條unigenes序列，平均長度為669bp。NR注釋的結果表明，94.3％的un

3、igenes與赤擬谷盜Tribolium castaneum(Herbst)和中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae Hopkins的unigenes相似性最高。對unigenes按照COG功能注釋，可分為25個功能群，其中一般功能預測類，復制、重組和修復類包含的unigenes個數(shù)最多，分別為3，051條和1，349條。
　　對松褐天牛觸角轉錄組信息進一步篩選比對，共獲得OBPs基因全長序列25條，片段序列4

4、條;化學感受蛋白(CSPs)全長序列8條，片段序列4條;氣味受體(ORs)全長序列1條，片段序列8條;1條感覺神經(jīng)元膜蛋白(SNMPs)全長序列。
　　2.松褐天牛MaltOBPs基因的克隆及序列分析
　　通過RT-PCR技術成功克隆了松褐天牛MaltOBP9、MaltOBP10、MaltOBP19、MaltOBP21、MaltOBP24基因(GenBank登錄號分別為:KF977562、KF977563、KF977572、

5、KF977574、KF977577)，開放閱讀框分別為423、435、615、390、510bp，各編碼140、144、204、129、169個氨基酸，分別有19、25、18、18、0個氨基酸殘基的信號肽;其中MaltOBP9和MaltOBP21屬于Minus-C OBPs，MaltOBP10屬于Classic OBPs，MaltOBP19和MaltOBP24屬于Plus-C OBPs;系統(tǒng)進化樹表明，Classic OBPs家族、Mi

6、nus-C OBPs家族和Plus-C OBPs家族分枝明顯。
　　3.松褐天牛MaltOBPs基因的時空表達譜
　　通過qPCR檢測松褐天牛5個MaltOBPs基因的時空表達情況。結果表明，這5個MaltOBPs基因在雌雄蟲下唇須和下顎須的表達量普遍較高，在觸角、頭、足、腹和翅也有一定的表達;且這5個MaltOBPs基因在觸角中的表達量因成蟲齡期、性別和交配狀態(tài)的不同而呈現(xiàn)差異。
　　4.松褐天牛MaltOBPs的原

7、核表達、純化及結合特性
　　成功構建了重組質粒pET20b-MaltOBP9、pET20b-MaltOBP10、pET20b-MaltOBP19、 pET17b-MaltOBP24、 pGEX-6P-1-MaltOBP21。pGEX-6P-1-MaltOBP21在上清中表達，通過GST4B親和層析柱和Precission protease酶切獲得MaltOBP21純蛋白;pET20b-MaltOBP9、pET20b-MaltOBP

8、10、pET20b-MaltOBP19、pET17b-MaltOBP24主要在包涵體中表達，經(jīng)過包涵體變復性、DE52弱陰離子交換柱及QFF強陰離子交換層析柱獲得純蛋白。
　　選擇1-NPN為熒光探針，利用熒光競爭結合實驗測定這5個MaltOBPs在中性和酸性pH環(huán)境下與18種寄主植物揮發(fā)物單體的結合特性，它們在中性pH環(huán)境下與揮發(fā)物的結合能力普遍高于酸性pH環(huán)境。在中性條件下，2個屬于Minus-COBPs家族的MaltOBPs

9、對其中4種揮發(fā)物都表現(xiàn)出較強的結合能力;2個屬于Plus-C OBPs家族的MaltOBPs結合特性方面表現(xiàn)比較大的差異，其中一個MaltOBPs對17種揮發(fā)物均表現(xiàn)出強結合力，而另一個MaltOBPs僅對5種揮發(fā)物表現(xiàn)強結合力。屬于Minus-C OBPs，Classic OBPs，Plus-C OBPs家族的5個MaltOBPs結合特性之間并未表現(xiàn)出明顯的特征。
　　本研究為明確松褐天牛氣味結合蛋白的功能，研制行為調(diào)節(jié)劑以及明