缺氧與缺氧誘導的自噬調控對結腸癌HCT116細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的：
　　 研究缺氧對結腸癌HCT116細胞HIF-2α表達，細胞增殖、凋亡及自噬等生物學特性的影響以及探討自噬在細胞缺氧中的作用。
　　 方法：
　　 ①通過缺氧培養(yǎng)建立人結腸癌HCT116細胞的缺氧模型，觀察缺氧對結腸癌HCT116細胞生物學行為的影響；缺氧培養(yǎng)結腸癌HCT116細胞12h、24h、48h作為實驗組(檢測HIF-2α蛋白表達的實驗中實驗組為缺氧培養(yǎng)腸癌HCT116細胞6h，12h、24h、4

2、8h)，常氧培養(yǎng)48h作為對照組(MTT實驗中對照組為常氧培養(yǎng)12h、24h、48h)；缺氧培養(yǎng)后，采用MTT法測定缺氧培養(yǎng)對結腸癌細胞增殖的抑制作用；應用流式細胞技術檢測細胞周期的變化；應用免疫印跡Western Blot方法檢測缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α)及自噬特異性蛋白微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain

3、3，LC3）的表達；②缺氧培養(yǎng)條件下利用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）特異性抑制結腸癌細胞自噬24h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化；應用Western Blot方法檢測LC3蛋白白勺表達，觀察細胞自噬抑制情況；采用流式細胞儀技術JC-1法檢測結腸癌細胞線粒體膜電位的變化；應用Annexin V-PI雙染檢測細胞凋亡情況。
　　 結果：
　　 ①缺氧培養(yǎng)結腸癌HCT116細胞后結腸癌

4、細胞增殖明顯受到抑制，12h、24h、48h的抑制率分別為23.53％±2.93%、38.47%±1.39%、50.94%±1.17%；流式細胞技術檢測細胞周期結果顯示缺氧培養(yǎng)12h、24h、48h后G1期比例從常氧狀態(tài)下的54.65%逐漸升高到74.80%，而S期則從常氧狀態(tài)下的39.65%逐漸降低到12.46%，缺氧組與對照組比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，說明隨著缺氧時間的延長，細胞增殖活力明顯受到抑制；Western Blo

5、t檢測結果顯示常氧狀態(tài)，HIF-2α表達量很少，而缺氧6h時HIF-2α即有明顯的的增加，隨著缺氧時間的延長，HIF-2α的表達持續(xù)升高，缺氧48h后仍維持在較高水平；LC3的表達實驗中實驗組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值隨著缺氧時間的延長逐漸升高，缺氧48h后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值由常氧狀態(tài)下的0.263±1.67%升高到0.79±1.47%(P＜0.05)，表明缺氧明顯上調結腸癌HCT116細胞的自噬水平；②缺氧培養(yǎng)條件下利用自噬抑

6、制劑3-MA特異性抑制結腸癌細胞自噬24h，倒置顯微鏡下觀察細胞顯示，缺氧條件下培養(yǎng)細胞24h時，細胞形態(tài)有明顯變化，表現(xiàn)為細胞離散，皺縮，而應用3-MA抑制自噬時此種現(xiàn)象更為明顯；Western Blot檢測LC3的表達實驗中顯示，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯降低，說明3-MA明顯抑制缺氧誘導的細胞自噬；流式細胞術檢測細胞線粒體膜電位的實驗中顯示缺氧培養(yǎng)條件下抑制結腸癌細胞自噬24h時，綠色熒光的細胞占總細胞的比值明顯低于其他各組(