慢病毒介導hVEGF165-GFP基因轉染內皮祖細胞移植治療MODS后器官微血管密度變化的研究.pdf

1、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)是臨床重癥患者死亡的主要原因之一。其發(fā)病機制尚未明確，最新研究認為全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)使得自體修復功能障礙，并進一步造成微血管損傷、微循環(huán)障礙，從而引起MODS，同時這可能就是MODS的始發(fā)環(huán)節(jié)。
　　 內皮祖細胞(Endothelial

2、 progenitor cell，EPC)是成熟血管內皮細胞的前體細胞，屬于干細胞群體，既可不斷增殖又能定向分化為成熟的內皮細胞。EPC不僅參與人胚胎血管生成，同時也參與出生后血管新生和血管內皮損傷后的修復過程，是目前研究損傷血管修復的熱點之一。
　　 大量的動物和臨床實驗都已經證明：當組織受到一定程度的損傷時，循環(huán)及組織中EPC可以在組織內分化為內皮細胞替換功能障礙的內皮細胞、修補裸露的血管內皮損傷區(qū)，并參與缺血或損傷組織內新

3、血管生成，從而改善缺血器官的功能；然而，當機體受到過度的損傷刺激時，EPC的分化、遷徙功能也會發(fā)生嚴重障礙，則會導致?lián)p傷部位微循環(huán)嚴重損害而無法得到修復，從而發(fā)生器官功能障礙。
　　 研究顯示，VEGF基因修飾的EPC移植治療創(chuàng)傷后缺血性疾病，將可能最大程度的發(fā)揮兩者促血管再生作用，移植VEGF基因修飾的EPC可以顯著降低MODS的發(fā)生率，并改善MODS的預后。為此，本文從EPC對自體修復的角度出發(fā)，探討攜帶VEGF-綠熒光蛋白

4、(Green Fluorescent Portein，GFP)雙表達基因慢病毒轉染EPC后的細胞特性及移植慢病毒介導hVEGF165-GFP基因轉染的內皮祖細胞預防和治療MODS的理論依據(jù)。
　　 本研究共分為四部分，首先通過內毒素+失血性休克制造出MODS的家兔動物模型，同時在體外建立起EPC培養(yǎng)和鑒定體系，由慢病毒(LV)轉染VEGF-GFP雙表達基因的EPC，將體外培養(yǎng)增殖轉染EPC移植入MODS的動物，觀察移植后MODS

5、的發(fā)生率和重要臟器的微血管密度改變情況，評價移植轉染VEGF-GFP雙表達基因的EPC防治MODS的效果，并對其作用機制進行初步探討。
　　 第一部分多器官功能障礙動物模型的建立
　　 在本研究的第一部分我們首先成功地復制了雙相遲發(fā)型的家兔MODS模型，為創(chuàng)傷后多器官功能障礙的相關研究提供了實驗基礎。
　　 將體重2.52±0.27Kg健康雄性家兔隨機分為2組：實驗組(MODS)12只，施行失血性休克+內毒素血癥

6、復合因素；對照組(C)12只，施行假手術，予以頸動靜脈置管，不實施失血及內毒素注射。監(jiān)測各重要器官功能變化，并行主要器官病理形態(tài)學檢查(大體、光鏡)。結果顯示各重要器官功能下降或衰竭。病理學改變主要表現(xiàn)為炎癥為主的非特異性改變。實驗組MODS發(fā)生率為83.3％，死亡率為75.0％，顯著高于對照組。本實驗采用二次打擊，與臨床實際相符，且MODS的發(fā)生率及死亡率均高，操作簡單，容易復制，是一個較成功的動物模型。
　　 第二部分攜帶V

7、EGF-GFP雙表達基因慢病毒載體的建立及體外轉染內皮祖細胞
　　 本部分通過建立可穩(wěn)定攜帶VEGF+GFP的雙表達基因的慢病毒載體，并轉染體外培養(yǎng)的內皮祖細胞，為下一步的回輸治療提供充足的細胞源。
　　 hVEGF165的PCR引物并擴增，經酶切、連接轉化至含GFP的慢病毒表達載體：pWPXL-MOD后挑取陽性克隆，利用限制性內切酶BamHⅠ、MluⅠ雙酶切后經電泳鑒定并測序。含VDGF-GFP的表達載體pWPXL-M

8、OD與慢病毒包裝質粒：pRsv-REV，pMDlg-pRRE，及包膜質粒pMD2G共同組成四質粒系統(tǒng)，通過磷酸鈣法共轉染293T細胞后獲得慢病毒顆粒，經濃縮后可獲得高滴度的LV-VEGF-GFP。在MOI值=50的條件下與EPC共培養(yǎng)以感染EPC。對LV/hVEGF165-GFP-EPC進行增殖功能進行檢測。結果表明，目的基因插入慢病毒過表達載體pWPXL-MOD后經PCR擴增，證實載體片段與目的片段均可表達，并且基因測序報告顯示：重組

9、質粒中的插入片段序列與目的基因VEGF的CDS序列一致，成功構建并包裝了慢病毒載體，并證實EPC經LV/hVEGF165-GFP轉染后其增殖功能較未轉染EPC提高。
　　 第三部分慢病毒介導hVEGF165-GFP基因轉染內皮祖細胞移植治療MODS后器官微血管密度變化及意義
　　 本部分旨在探討移植慢病毒介導hVEGF165-GFP基因轉染的內皮祖細胞對家兔創(chuàng)傷后多器官功能障礙治療的有效性和安全性的研究，同時比較單純移植

10、EPC治療MODS的療效差異。
　　 構建動物模型，將達到MODS的動物隨機分為三組，單純EPC移植組(ET)12只和轉染內皮祖細胞移植組(VT)12只，在固定時間點，分別以1×107個細胞/Kg(體重)的劑量進行移植治療。同時以未行任何干預的MODS(M組，12只)作為對照細。
　　 結果顯示：慢病毒介導hVEGF165-GFP基因轉染內皮祖細胞移植組(VT)的MODS發(fā)生率和動物死亡率均低于單純移植EPC組(ET)和