三株不同海洋生境來源真菌次級代謝產(chǎn)物及生物活性研究.pdf

1、存在于不同小的生態(tài)環(huán)境中的微生物,由于其生存環(huán)境的差異性、物種競爭性以及物種自身受環(huán)境的影響而不斷進化,使得同屬或者同種之間的微生物的基因表達會產(chǎn)生穩(wěn)定的差異,而這種穩(wěn)定的差異在脫離生存環(huán)境后可能在很長的時期內(nèi)還會保持表達。因此,不同生境來源的微生物,在實驗室條件下這種穩(wěn)定的、差異性的表達,其結(jié)果可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)多樣性的次級代謝產(chǎn)物,為人類發(fā)現(xiàn)新型藥物先導(dǎo)化合物奠定了資源基礎(chǔ)。
　　本課題組通過菌株多級串聯(lián)篩選技術(shù)已構(gòu)建成不同海洋環(huán)境

2、來源菌株資源庫,本文建立在該菌株資源庫的基礎(chǔ)上,選取了3株生存環(huán)境迥異的海洋來源真菌,開展了系統(tǒng)的次級代謝產(chǎn)物、生物合成以及生物活性研究。從以下具體內(nèi)容開展研究:運用OSMAC策略優(yōu)化培養(yǎng)條件;單體化合物的分離、化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定以及立體化學(xué)研究;新結(jié)構(gòu)的生物合成研究;單體化合物活性初步評價,高活性化合物的構(gòu)效關(guān)系探討,分子作用靶點的確定以及分子對接試驗。
　　首先采用 OSMAC策略對目標(biāo)菌株進行發(fā)酵條件的優(yōu)化。實驗表明殼青霉

3、Penicillium crustosum PRB-2對培養(yǎng)體系敏感,在39種培養(yǎng)條件中確定了最優(yōu)的規(guī)模發(fā)酵條件。球孢枝孢菌Cladosporium sphaerospermum2005-01-E3在大米培養(yǎng)基和豆粉培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物差別明顯。
　　利用常規(guī)色譜、MPLC、HPLC、手性 HPLC等分離技術(shù)從紅樹林根際環(huán)境來源雜色曲霉A. versicolor pjx-9發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到27個單體化合物(1-27);從南極深海來

4、源真菌殼青霉 P. crustosum PRB-2中分離得到36個單體化合物(28-63);從太平洋深海來源真菌球孢枝孢菌C. sphaerospermum2005-01-E3中分離得到7個單體化合物(64-70);共分離得到70個單體成分。
　　運用波譜技術(shù)、X-ray單晶衍射技術(shù)、ECD技術(shù)(比較ECD和ECD計算)、化學(xué)轉(zhuǎn)化溝通、mosher′s法、marfey實驗、質(zhì)譜以及物理性質(zhì)等鑒定技術(shù)闡明了全部70個單體化合物的結(jié)構(gòu)

5、,結(jié)構(gòu)類型包括二聚xanthone類結(jié)構(gòu)15個(1-15),蒽醌類4個(16-19),甾醇類2個(22-23),含clavatol類的結(jié)構(gòu)16個(28-43),生物堿類20個(20-21,24-25,55-70),苯衍生物以及其他類13個(26-27,44-54)。其中發(fā)現(xiàn)新化合物33個,包括13個由多種單體和2-2′、罕見的2-4′和4-4′等不同連接方式組合構(gòu)建的、新穎且具有復(fù)雜立體化學(xué)的二聚xanthone類結(jié)構(gòu)(1-12,15)

6、;2個含有新穎的、高度氧化的3,3a,9,9a-tetrahydro-1H-furo[3,4-b]chromen-1-one碳骨架結(jié)構(gòu)(28,29);2個含有互變特性6a-hydroxy-6,6a,12,12a-tetrahydro-5H-benzo[a]xanthen-5-one新骨架化合物(42,43);5個具有monoclavatolα-furanone新結(jié)構(gòu)類型的化合物(31-34,36);2個具有monoclavatolα-p

7、yranone新結(jié)構(gòu)類型的化合物(38,39);1個新的環(huán)氧開環(huán)的苯二氮卓類結(jié)構(gòu)(55);一類新穎的、結(jié)構(gòu)互變的且含有未見報道的6(3)-enamino-8,10-dihydroxy或6(3)-enamino-7(8)-en-10-ol側(cè)鏈的tetramic acid類衍生物(64-67,69-70)以及1個生物合成相關(guān)產(chǎn)物(68);此外還發(fā)現(xiàn)3個新天然產(chǎn)物(14,44-45)。首次運用X-ray單晶衍射技術(shù)、ECD電子圓二色譜等多種技

8、術(shù)解決了二聚xanthone類結(jié)構(gòu)(1-15)中存在的具有挑戰(zhàn)性的絕對構(gòu)型問題;運用X-ray單晶衍射技術(shù)、ECD電子圓二色譜法以及物理性質(zhì)確定了新骨架penilactones A和B(28,29)具有正相反絕對構(gòu)型以及monoclavatolα-furanone類(30-36)的絕對構(gòu)型;正在采用HPLC-ECD實驗以及ECD計算等技術(shù)確定立體結(jié)構(gòu)互變的、新穎骨架42的絕對構(gòu)型;利用丙叉化實驗,Mosher’s法以及耦合常數(shù)確定了新穎

9、的tetramic acid類產(chǎn)物64-67,69-70的相對構(gòu)型和絕對構(gòu)型,并闡明了互變作用機制;采用Marfey實驗確定了68中氨基酸的構(gòu)型。
　　生物合成研究方面,采用13C同位素飼喂實驗證實了新骨架 penilactone A(28)和生物合成相關(guān)產(chǎn)物35是由混源的PKS和TCA循環(huán)途徑產(chǎn)生,代表了一類自然界中非常少見的以這兩種混源途徑產(chǎn)生的化合物;38則證實是由 PKS途徑產(chǎn)生。通過考察產(chǎn)物產(chǎn)生時間順序、發(fā)酵液pH變化、

10、化合物穩(wěn)定等實驗表明化合物13在發(fā)酵初期可能轉(zhuǎn)化成了酸穩(wěn)定的Secalonic acid D(SAD,14),而SAD在整個發(fā)酵過程中很可能穩(wěn)定的存在。
　　生物活性方面,采用MTT法和SRB法對單體化合物進行活性初步評價,化合物2,5,6,8,9,12-14對7株腫瘤細(xì)胞株顯示出顯著的、廣譜的增殖抑制活性,IC50在0.4-10μM之間,并初步探討了這類結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系。其中阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體8和9對腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出選擇增殖抑制活性,化合

11、物8對胃癌細(xì)胞株MGC803的增殖抑制活性最好(IC50為4.6μM),對正常人胚腎細(xì)胞HEK293的IC50大于50μM。DNA Topo I松弛活性實驗證實拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topo I)是高活性化合物2,8,9的活性作用靶點之一,且阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體8的Topo I抑制活性強于9?；衔?的抗腫瘤活性作用機制在進行中。此外,化合物42和43表現(xiàn)出對胃癌細(xì)胞株MGC803以及HL-60中等細(xì)胞毒活性。化合物66顯示出了中等的抗A H1N1病毒的

12、活性。
　　本文闡明了3株海洋來源真菌中70個次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu),其中新化合物33個和新天然產(chǎn)物3個;發(fā)現(xiàn)一類結(jié)構(gòu)多樣、抗腫瘤活性顯著、結(jié)構(gòu)新穎的二聚xanthone類化合物,2類新骨架結(jié)構(gòu)(新骨架28被NPR評為“熱點化合物”)和一類新穎的tetramic acid類衍生物,并采用多種技術(shù)手段確定了這些結(jié)構(gòu)新穎化合物的絕對構(gòu)型。根據(jù)二聚xanthone結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生的時間和模擬pH實驗初步討論了這類結(jié)構(gòu)的生物合成過程;13C同位