內毒素血癥幼年大鼠小腸粘膜損傷時JNK-c-Jun及PI3K-Akt信號轉導通路的作用及谷氨酰胺保護作用機制的研究.pdf

1、嚴重感染是兒科危重癥中胃腸功能障礙的常見病因之一，其發(fā)病機制與內毒素血癥和腸屏障功能破壞密切相關。內毒素系革蘭氏陰性桿菌細胞壁成份，其主要生物活性成份為脂多糖(lipopolysacchcride，LPS)。胃腸功能障礙在危重癥中的重要性越來越受到重視，被認為是多臟器功能障礙的始發(fā)因素之一。小兒胃腸功能障礙和衰竭，常提示病情加重和預后不良。機體在受到革蘭氏陰性細菌的感染時，LPS作用于細胞膜受體，通過細胞內信號傳遞級聯(lián)使基因表達發(fā)生變化

2、，導致宿主細胞因子失控性表達，細胞發(fā)生代謝、形態(tài)等的變化，介導細胞損傷的發(fā)生發(fā)展。因此LPS介導的信號轉導機制已成為一個廣泛注意的研究領域，近年來已取得了不少進展。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路是信號從細胞表面轉導到細胞核內部的重要傳遞者，目前已確定出四條MAPK信號轉導通路，即細胞外信號調節(jié)激酶(extra cellular signal regu

3、lated proteinkinase.ERK)通路、C-Jun氨基未端激酶(C-Jun amino terminal kinase，JNK)通路、P38通路和ERK5通路。JNK信號轉導通路是LPS信號轉導通路中的一條重要通路，c-jun是JNK下游的直接作用底物。除了被生長因子激活外，JNK通路還能被LPS、TNF-α、L-1、紫外線、射線、熱休克、細胞外高滲及DNA變性劑等激活。JNK 通路的激活與多種系統(tǒng)的促凋亡作用有關。有研究

4、報道，枯否細胞中JNK是LPS信號轉導途徑中的重要信號分子；JNK的激活可能參與了腦缺血所致神經(jīng)元的損傷及腦低氧預適應的發(fā)生和發(fā)展；在IL-10基因缺失鼠小腸缺血再灌注損傷模型中，也發(fā)現(xiàn)了JNK/C-Jun信號轉導通路的異常激活。但有關嚴重感染致胃腸粘膜損傷時JNK/c-Jun通路的變化國內外研究報道還很少。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide-Kinase，P13K)是生長因子超家族信號轉導過程中的重要分子， Akt是

5、原癌基因c-akt的表達編碼的絲/蘇氨基酸激酶，是P13K直接的靶蛋白。P13K主要通過生長因子與受體結合而激活，具有抗凋亡及促進細胞增殖分化的作用，與多種生物學事件有關，如囊泡運輸、細胞骨架重建、細胞存活、腫瘤發(fā)生、細胞凋亡等。P13K信號轉導通路作為細胞的主要存活通路，對腸上皮細胞的存活、增殖和重建十分重要。有研究表明，P13K是激活NF-KB的上游途徑，而NF-K B信號轉導通路是LPS所介導的信號轉導通路中最重要的下游通路，活化

6、的NF-KB可誘導眾多炎癥相關的特異基因如TNF，L-6，L-8等的表達。但有關LPS與P13K/AKT信號轉導通路的研究很少，國內尚未見報道。 谷氨酰胺(Glutamine,Gln)是血液循環(huán)和組織內游離氨基酸池中含量最豐富的一種氨基酸。腸粘膜和其它迅速增生的細胞的主要能量來源是Gln而非葡萄糖。許多動物實驗及臨床研究表明，Gln可以從維持腸粘膜屏障、對腸免疫功能的調節(jié)以及對腸道氧化損傷的保護作用等三個方面起到對腸屏障功能的保

7、護作用。適當劑量Gln的腸外營養(yǎng)和腸內營養(yǎng)，可以增加腸絨毛高度及粘膜表面積和隱窩深度，增加隱窩細胞的有絲分裂，加快腸上皮細胞的更新速度，增強修復能力，并能促進腸道粘液素的合成，增強腸粘膜細胞間的緊密連接，減少上皮細胞的凋亡，阻止腸粘膜萎縮及炎癥所致的通透性增加。目前，對Gln能改善各種病理狀態(tài)的腸粘膜生長修復作用已給予充分的肯定，尤其在燒(創(chuàng))傷、感染、手術后、放化療腫瘤病人己取得一定效果。但其作用機制尚不完全清楚。 總之，LP

8、S通過作用于細胞膜受體，激活多條細胞內信號轉導系統(tǒng)，形成一個錯綜復雜的信號轉導網(wǎng)絡，最終導致內毒素性休克，全身炎癥反應綜合征和多器官功能衰竭等疾病的發(fā)生。尤其在小兒，因其自身的免疫功能以及腸道的屏障功能不全，嚴重感染所致的胃腸功能障礙，常是誘發(fā)其它器官功能障礙的原因，治療有一定的難度，一旦到晚期病死率極高，而小兒胃腸功能障礙的發(fā)病機理還不完全清楚，本研究對內毒素血癥及谷氨酰胺治療后小腸粘膜JNK/c-Jun及P13K/Akt信號轉導通路

9、進行研究，旨在探討LPS引起小腸粘膜損傷及谷氨酰胺對其保護作用的有關細胞信號轉導機制，以探索有效的預防和治療途徑。 實驗材料與方法： 1、材料： 用腹腔注射內毒素(4mg/kg大腸桿菌脂多O55:B5)方法制備18日齡大白鼠內毒素血癥模型。不加任何處理因素為正常對照組，該組8只鼠。腹腔注射生理鹽水為假注射對照組，腹腔注射內毒素為內毒素組，腹腔注射內毒素同時腹腔注射谷氨酰胺(2g/kg)為谷氨酰胺治療組，每組40只

10、鼠，分別于實驗開始后2、4、6、24及72h各取8只鼠末段回腸4cm，分別放入10％中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片；2.5％戊二醛中保存，行電鏡檢測；液氮中速凍，儲存于-76冰箱，行蛋白及核酸檢測。 2、方法: 光鏡和透射電鏡下觀察小腸粘膜病理改變，免疫組化法檢測小腸粘膜增殖細胞核抗原(PCNA)表達，原位末端標記(TUNEL)法檢測小腸上皮細胞的凋亡，RT-PCR法檢測JNK、c-Jun、P13K及AKTmRNA的表達

11、，Western Blot印跡分析檢測P13K總蛋白和JNK、c-Jull及AKT磷酸化蛋白的表達。采用SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。 實驗結果: 1、小腸形態(tài)學改變光鏡下小腸無明顯病理改變，電鏡下內毒素組出現(xiàn)不同程度各種凋亡形態(tài)學改變，谷氨酰胺組相應各時間點病變程度有所減輕。 2、小腸上皮細胞的增殖及凋亡對照組小腸上皮PCNA陽性細胞很多，內毒素組PCNA表達強度明顯低于對照組(P<0.01)，2h表達

12、強度即明顯降低，4h-6h達到最低值，72h仍未恢復正常水平。谷氨酰胺組PCNA表達明顯高于內毒素組(P<0.01)，但低于對照組(P<0.01)。與內毒素組比較，2h、4h和24h時間點升高顯著。 對照組凋亡細胞很少，內毒素組凋亡指數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)，2h凋亡指數(shù)即明顯升高，24h達到高峰，72h仍未恢復正常。谷氨酰胺組凋亡指數(shù)雖較對照組高(P<0.01)，但各時間點均較內毒素組下降(P=0.01)。谷氨酰胺組凋

13、亡指數(shù)隨時間而增加，72h尚未出現(xiàn)回落趨勢。 3、小腸JNK、c-Jun mRNA和蛋白表達分析內毒素組JNK mRNA表達較對照組明顯增強(P<0.01)，2h開始明顯升高，6h達到高峰，72h尚未恢復正常。C-JuN mRNA的表達趨勢與JNK mRNA的表達相同。谷氨酰胺組JNK及c-Jun mRNA表達較內毒素組有下降趨勢，但均無統(tǒng)計學意義。 內毒素組p-JNK蛋白表達較對照組明顯升高(P<0.01)，2h即開始

14、升高，4-6達到高峰，72h尚未恢復正常。谷氨酰胺組p-JNK表達雖較對照組高(P<0.01)，但較內毒素組明顯下降(P=0.01)，其中4h和6h處下降顯著，高峰位于6h處。P-c-J吼蛋白表達趨勢與p-JNK表達相似，不同的是谷氨酰胺組p-c-Jun蛋白高峰位于4h處。 4、小腸P13K、Akt mRNA和蛋白表達分析內毒素組P13K mRNA較對照組表達明顯增強(P=0.05)，4h開始明顯升高，6h達到高峰，其它時間點表

15、達無明顯差異。谷氨酰胺組表達明顯高于內毒素組(P<0.05)。內毒素組.Akt mRNA較對照組表達無明顯升高，谷氨酰胺組與內毒素組比較亦無明顯升高。 P13K總蛋白表達與P13K mRNA表達相似。P-Akt蛋白表達趨勢與P13K蛋白及Akt mRNA表達有所不同，內毒素組p-Akt蛋白較對照組表達明顯增高(P<0.01)，4h開始明顯升高，24h才達高峰，72h表達水平與對照組已無顯著差別。谷氨酰胺組p-AKT蛋白表達明顯高

16、于內毒素組(P<0.01)，2h開始顯著升高，4h達最高峰，6h后與內毒素組幾乎相同。 結論: 1、內毒素血癥幼鼠小腸上皮細胞凋亡增加，增殖下降，細胞凋亡與增殖之間平衡的破壞是內毒素血癥時腸屏障破壞的病理機制之一。 2、內毒素血癥早期，幼鼠小腸JNK/c-Jun信號轉導通路被激活，導致小腸粘膜上皮細胞凋亡增加，損傷加重；晚期P13K/Akt信號通路被激活，參與小腸上皮細胞的存活和增殖。 3、谷氨酰胺通過抑