人和小鼠胚胎肺發(fā)育關鍵基因表達模式的比較研究.pdf

1、哺乳動物肺的發(fā)育起源于前腸腹側的內胚層。肺原基形成后，上皮組織不斷生長，并反復分支形成各級氣管，支氣管至肺泡。哺乳動物胎肺發(fā)育可以分為四個階段：假腺肺階段、微管肺階段、囊狀肺階段和泡狀肺階段。肺的發(fā)生涉及到許多復雜的分子機制。已有研究表明：Bmp、Fgf、Wnt、Shh等信號通路對小鼠胚胎肺分支形態(tài)發(fā)生及P-D軸形成至關重要。Fgf10在肺分支起始，于遠端間充質預定氣管形成區(qū)中表達，隨后擴散，與位于上皮的受體Fgfr2b結合激活該信號通

2、路，誘導肺芽形成。Bmp4主要在上皮中表達，并在分支的末端表達最強。它通過局部抑制上皮的增殖，對Fgf10信號進行負調控，阻止分支的延伸，從而導致新分支點的形成。肺上皮末梢的Shh信號既能抑制Fgf10的表達，又能激活Patched受體，從而通過Gli3、Foxf1積極調控Fgf10的表達。另外，Hhip被Shh誘導表達后會反過來抑制Shh信號而促進Fgf10的表達。因此，在肺芽遠端，高水平的Shh和Hhip就導致該區(qū)域較鄰近的間充質有

3、更少的Shh信號，更多的Fgf10表達。而遠離肺芽遠端末梢處低水平的Shh信號則能誘導鄰近間充質中更多Fgf10的表達，這就導致肺芽隨后新的側邊分支的產生。在肺芽分支過程中，上皮中的Wnt經典通路會激活Fgfr 2b的表達，而間充質中的Wnt信號(單獨作用或與上皮中的Wnt一起)則會抑制Fgf10的表達，這就保證了肺芽僅在特定位置出現。非經典通路的Wnt信號分子Wnt5a在經典Wnt信號作用之后(肺發(fā)育的中期，肺泡形成時)，對遠端的發(fā)育

4、起著決定性的作用。剔除Wnt5a，會導致胎肺上皮過度分支：過表達則表現為分支不足，遠端氣道明顯膨大。目前關于這些因子在人胚胎肺發(fā)育過程中的表達調控作用和表達模式與小鼠是否接近未有報道。此外，已有報道說對哺乳動物胚胎發(fā)育至關重要的同源異型框基因Shox2在小鼠面額部、肢體、心臟以及骨骼的發(fā)育中起著重要的調控作用，SHOX2與人類胚胎發(fā)育過程中肢芽、鰓弓、鼻、心臟、中樞神經系統(tǒng)的形成有關，但關于該基因基因對哺乳動物胎肺發(fā)育的影響及在其信號傳

5、導通路中的作用還未見報道。 為研究人胚胎肺發(fā)育的形態(tài)學特征，為深入研究人胚胎肺發(fā)育過程中各基因的表達調控和作用機制，并為人胚胎肺發(fā)育過程中相關疾病的診斷和治療奠定基礎，本實驗首先比較了人與小鼠胚胎肺發(fā)育早、中期的形態(tài)特征，接著檢測了人胚胎肺中相關基因的表達情況，并與同期鼠胚進行比較。同時，本研究首次檢測了Shox2和SHOX2基因在小鼠和人胚胎肺中的表達，并以Shox2基因敲除小鼠為模型，研究了Shox2對胎肺發(fā)育的影響。論文主

6、要分為以下兩個部分進行。 第一部分，本實驗利用組織學的研究方法，根據人胚胎肺來源的時期，取人胚假腺肺早、中、末期及微管肺中期的胎肺進行組織學切片，觀察其形態(tài)變化特征，并與同期野生型小鼠胚胎肺結構進行比較。組織學結果顯示：在人胚假腺肺階段，肺呼吸樹開始發(fā)育，形成相互通連的氣管和各級支氣管，并在細支氣管木端再分支形成短管束；到了微管肺階段，分支的短管束伸長，并進一步向外周分支、擴展形成終末導管，肺泡開始發(fā)育，血管開始形成并整合入肺泡

7、上皮細胞之間。在與同期小鼠胚胎肺發(fā)育形態(tài)進行比較后可以初步得出結論：人和小鼠在胚胎肺發(fā)育早、中期形態(tài)特征基本相似，這為后續(xù)以小鼠為模型研究人類肺部疾病提供了一定的依據。 第二部分，本研究利用RNA原位雜交技術及RT-PCR的方法檢測了關鍵基因在人胚胎肺發(fā)育各階段的表達模式。 首先，本實驗檢測了在小鼠胚胎肺發(fā)育中起重要調控作用的4個基因BMP4FGF、 WNT、SHH在人胚胎肺早期和中期的表達。結果發(fā)現：SHH在人胚胎肺發(fā)

8、育的假腺期早期和末期的肺上皮中均有較強烈表達，且沿P-D軸(proximal-distal axis，近—遠端軸線)呈梯度表達，在上皮末梢表達最為強烈，至微管肺中期，已未見SHH的明顯表達；WNT5A在假腺肺早期的肺上皮末梢及間充質中呈微弱表達，至假腺肺末期表達水平有所上升，到了微管肺中期，WNT5A開始呈現彌散狀表達，在近端支氣管及末端肺泡上皮細胞中均有較強烈表達；BMP4則在假腺肺早期、末期及微管肺中期均無明顯表達；FGF10在假腺

9、肺早期、末期及微管肺中期的肺上皮中呈微弱表達。與同期的小鼠胚胎肺比較后發(fā)現：SHH和WNT5A在人胚胎肺中的表達模式與小鼠基本一致，但BMP4和FGF10在人胚胎肺中的表達與小鼠存在顯著差異。 其次，本實驗首次檢測了Shox2基因在小鼠胚胎肺中的表達模式，結果顯示Shox2基因在小鼠胚胎假腺肺早、中期的肺上皮中均有明顯特異性表達，至假腺肺末期，Shox2基因的表達水平已有所下降，到了微管肺階段，Shox2基因已基本不表達。由此，

10、為了進一步研究Shox2在小鼠胚胎肺發(fā)育中所起的作用，我們以小鼠為模型，利用已構建好的Shox2基因敲除小鼠從組織形態(tài)學上初步研究了Shox2基因對小鼠胚胎肺發(fā)育的影響，通過與同期野生型鼠胚相比，來觀察Shox2基因敲除小鼠胚胎肺發(fā)育各階段的情況。結果發(fā)現：至E17.5時，Shox24-/-型小鼠胚胎肺發(fā)育的形態(tài)與同期C57BL/6野生型小鼠胚胎肺的形態(tài)出現重大差別。在E17.5微管期結束原始腫泡期開始時，突變體小鼠的胎肺發(fā)育未能發(fā)生終

11、末導管的擴張、分隔形成以及肺泡細胞的分化等組織形態(tài)學上的變化，不能形成成熟肺泡，而是仍然處于細支氣管的分支過程，并且形成的分支數量遠遠多于野生型小鼠。研究結果顯示Shox2基因在小鼠胚胎肺發(fā)育過程中起著重要的調控作用，但其作用機制還有待于進一步研究證實?；赟hox2基因在小鼠胚胎肺中的表達情況及其對于小鼠胚胎肺發(fā)育的調控作用，本實驗進一步檢測了SHOX2基因在人胚胎肺中的表達模式，發(fā)現其與同期鼠胚胎肺中Shox2的表達模式極為相似。這

12、就說明SHOX2基因在人胚胎肺發(fā)育中所起的作用很可能與Shox2在鼠胚胎肺發(fā)育中所起的作用相似甚至相同，從而為以小鼠為模型研究人類肺部疾病奠定了基礎。 此外，鑒于BMP4和FGF10在人胚胎肺中的表達模式與小鼠存在差異，我們又利用RT-PCR的方法檢測了BMPs和FGFs家族其他成員的表達，結果顯示FGF7在假腺肺早期和微管肺早期均有較強表達：BMP3、BMP5、BMP7和FGF9在假腺肺早期有較強表達，到微管肺早期表達減弱：F

13、GF1于假腺肺早期有微弱表達，至微管腫早期已不表達：FGF2、FGF18在假腺肺早期和微管肺早期均未見其表達。由此我們初步推斷在人胚胎肺發(fā)育中BMPs和FGFs家族的其他成員可能代替或補償了BMP4和FGF10的功能，這有待于后續(xù)的實驗進一步研究證實。 本實驗在比較人和小鼠胚胎肺發(fā)育形態(tài)差異的基礎上，發(fā)現人和小鼠胚胎肺雖然存在形態(tài)發(fā)育上的相似性，但它們基因表達調控的分子機制還存著一定差異。同時推測在人胚胎肺發(fā)育過程中，RT-PC