PHD2對結腸癌細胞糖酵解活性的調控作用及分子機制研究.pdf

1、一、背景
　　 正常細胞向惡性細胞的轉化過程中伴隨著代謝途徑的重塑，其中最典型的是腫瘤細胞即便在氧氣供應充足的情況下也主要以糖酵解而非氧化磷酸化提供能量，這種糖代謝途徑的重塑被稱為有氧糖酵解或Warburg效應。該表型可促使腫瘤細胞產生凋亡耐受、生物合成前體分子生成增加以及侵襲能力增強。腫瘤細胞能量代謝的適應性改變也是導致腫瘤對放化療耐受的重要原因。目前，腫瘤糖代謝重塑的分子基礎和確切機制尚未完全闡明。
　　 實體腫瘤在

2、不斷生長的過程中，其中心會形成缺氧環(huán)境。腫瘤細胞為應對缺氧的壓力，遂啟動異?；钴S的糖酵解，同時啟動促血管機制以增加腫瘤血管形成，從而使自身得以存活和生長。在這一過程中，感受瘤體內氧分壓的改變并及時啟動腫瘤糖酵解是其中的關鍵環(huán)節(jié)。我們推測，作為細胞內最重要的氧感受器，脯氨酸羥化酶(prolylhydroxylases，PHDs)可能是上述關鍵環(huán)節(jié)的關鍵分子。
　　 現已證實在哺乳動物細胞中有三種類似的酶-PHD1、PHD2和PHD

3、3，它們都含有α、β兩個亞基，其中α亞基有脯氨酸羥化酶的活性。常氧時，PHD可將缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α的兩個脯氨酸殘基羥基化，介導其被蛋白酶體降解?，F已證實，PHD2是HIF-1α最重要的調控因子。此外研究發(fā)現，PHD2在多種腫瘤細胞系或腫瘤組織中表達缺失，提示其可能具有抑癌作用。目前已發(fā)現PHD2與腫瘤血管生成密切相關，且已證實腫瘤細胞能量代謝的改變早于腫瘤血管生成，那么PHD2

4、是否在腫瘤糖酵解代謝方面發(fā)揮作用，目前還有待研究。本研究擬采用基因干擾重建、免疫共沉淀等現代分子生物學技術，以結腸癌細胞為研究對象，首先通過干擾或重建PHD2表達，觀察腫瘤細胞在葡萄糖攝取、乳酸及能量分子生成等方面的相應變化，以明確PHD2對腫瘤糖酵解代謝的調控作用；進而研究主要能量相關通路在PHD2上述調控作用的活化情況，以期進一步闡明PHD2調控腫瘤糖酵解的分子機制。本研究不僅有助于加深對腫瘤糖酵解代謝機制的認識，而且能為針對腫瘤糖

5、酵解的有效靶向治療提供新策略。
　　 二、目的
　　 明確PHD2對腫瘤糖酵解代謝的調控作用，進一步闡明PHD2調控腫瘤糖酵解的分子機制。
　　 三、材料與方法
　　 1.采用免疫組化、Western blot及定量PCR的方法檢測人結腸癌組織及細胞PHD2及糖酵解相關蛋白的表達，并分析其相關性。運用Kaplan Meier生存曲線及多因素Cox模型分析PHD2在判斷結直腸癌患者預后的臨床價值。
　

6、　 2.采用RNA干擾、特異性抑制劑和基因過表達的方法，抑制結腸癌LS174T細胞PHD2及上調SW480細胞的PHD2，利用Western blot檢測PHD2及糖酵解相關蛋白HK2、PDK1和Glut1的表達，采用液閃測量、酶標法、高效液相層析檢測上述PHD2抑制或表達重建細胞的葡萄糖攝取量、乳酸生成量及ATP/ADP比值。利用Mitotracker檢測細胞的線粒體數量。
　　 3.采用液閃測量、酶標法、高效液相層析檢測P

7、HD2和HIF-1α雙干擾LS174T細胞的葡萄糖攝取量、乳酸生成量及ATP/ADP比值。利用Western blot和ELISA檢測抑制PHD2表達的LS174T細胞的LKBl/AMPK及IKK/NF-κB通路蛋白的活化情況。利用信號通路抑制劑結合液閃測量、酶標法、高效液相層析檢測NF-κB通路抑制劑對PHD2抑制的LS174細胞糖酵解效應。利用免疫共沉淀判斷NF-κB信號通路蛋白與PHD2的相互作用。
　　 四、結果

8、　　 1.PHD2在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常結腸組織。所檢測結腸癌腫瘤細胞僅LS174有稍高水平的PHD2表達，而其它細胞系均維持較低水平。結直腸癌組織中HK2、PDK1、Glut1 mRNA表達水平與配對癌旁組織之間差異均有統(tǒng)計學意義。KaplanMeier生存分析表明PHD2低表達的早期結直腸癌患者預后顯著差于高表達患者。多因素Cox模型分析發(fā)現，PHD2在結直腸癌患者中是一個獨立的預后因素。
　　 2.DMOG對

9、結腸癌細胞LS174T細胞PHD2蛋白表達的抑制呈濃度依賴。利用DMOG處理LS174T細胞后可促進糖酵解。采用PHD2干擾質粒轉染LS174T細胞后，其葡萄糖攝取量、乳酸產量以及ATP/ADP比值均顯著增加。用PHD2過表達載體轉染SW480細胞，Western blot檢測發(fā)現過表達PHD2的SW480細胞的糖酵解相關分子包括Glut1、HK2、PDK1的表達均顯著被抑制，其葡萄糖攝取量、乳酸產量以及ATP/ADP比值顯著下降

10、>　　 3.HIF-1α抑制并不能影響PHD2對結腸癌細胞糖酵解活性的調控作用；NF-κB信號通路的活化參與PHD2對結腸癌細胞糖酵解的調控；磷酸化AMPK可隨DMOG濃度的增加而上調。
　　 五、結論
　　 1.PHD2在結直腸癌組織和細胞中的表達顯著減少。PHD2可作為早期結直腸癌患者的預后指標。
　　 2.PHD2對結腸癌糖酵解活性方面發(fā)揮關鍵的調控作用。
　　 3.PHD2調控結腸癌糖酵解活性不