肺癌細胞系KRAS突變檢測及聯(lián)合通路抑制劑的生長抑制作用.pdf

1、自2010年以來，肺癌的靶向治療取得了很大進展，出現(xiàn)了許多針對EGFR，MET，HER2，VEGF和ALK等靶點的小分子藥物，尤其是針對EGFR的靶向藥物在臨床上顯示了很好的療效。但是仍有一部分患者耐藥，難以從EGFR的靶向治療中獲益[1]。這部分患者，細查原因，大部分是因為腫瘤細胞中存在KRAS突變[2]，但往往還有其他基因如PIK3CA和PTEN等基因的突變[3-5]。這些耐藥的患者的治療也成為了臨床上的難點，本課題即致力于這一方面

2、的研究。
　　 自80年代在人類腫瘤中檢出突變KRAS以來，因其與人類腫瘤的密切關(guān)系而備受關(guān)注，關(guān)于它的文獻數(shù)以萬計。大部分以臨床腫瘤標本為研究對象，也有以多種KRAS突變腫瘤細胞系為基礎(chǔ)進行研究的。為探討KRAS突變患者能否從小分子靶向治療藥物中獲益，我們選用KRAS突變肺癌的腫瘤細胞模型進行實驗。為了明確細胞資源中心所保藏的腫瘤細胞系中KRAS及相關(guān)的BRAF，EGFR，PIK3CA基因的突變情況，我們使用高分辨率溶解曲線技

3、術(shù)(HRM)對庫藏人類腫瘤細胞系進行突變的檢測。
　　 首先，我們提取了173種腫瘤細胞的總DNA，根據(jù)以往文獻報導(dǎo)KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因突變的熱點所在的6個DNA片段，進行PCR擴增，獲得高拷貝數(shù)的目標序列。然后進行高分辨率熔解。在時間和熒光的曲線上區(qū)分出野生型，突變雜合型和突變純合型的細胞系。篩查結(jié)果顯示在腫瘤細胞系中KRAS突變在所篩查的4個基因中最為常見，其中胰腺癌細胞系突變率為66.67％，結(jié)直

4、腸癌細胞系為52.94％，肺癌細胞系為21.25％，是突變率最高的三種腫瘤細胞系，與文獻報道的臨床腫瘤患者中KRAS的突變頻率相當:胰腺癌＞80％，結(jié)直腸癌≈50％，肺癌10-30％[6] PIK3CA、BRAF、EGFR基因的突變在腫瘤細胞系中突變頻率分別為14.45％、6.35％和4.62％。另外，我們還檢測到了COC1、A875、SF767、TE671及PANC-1細胞系中的一些未見報導(dǎo)的基因突變情況。
　　 篩查結(jié)果明確

5、了KRAS及相關(guān)基因在人類腫瘤細胞系中的突變情況，為開展腫瘤的靶向治療研究提供了很好的模型。同時證明HRM技術(shù)是一種低成本，靈敏，特異和高通量的實驗手段。
　　 根據(jù)前述突變檢測結(jié)果，選擇我們KRAS單突變的A549和KRAS/PTEN雙突變的NCI-H157兩株NSCLC細胞，觀察兩種信號通路抑制劑GDC-0941（PI3K/AKT/mTOR通路，PI3K抑制劑）和AZD6244（KRAS/RAF/MEK通路，MEK抑制劑）對

6、不同突變的NSCLC細胞的用藥效果。分別用不同濃度的GDC-0941和AZD6244單獨或聯(lián)合作用，MTT法初步觀察對細胞增殖的影響。根據(jù)觀察結(jié)果確定聯(lián)合給藥的濃度。設(shè)立無藥對照組、PI3K單獨抑制組(GDC-0941，0.5/5.0μmol/L)、聯(lián)合Ⅰ組(0.5μ mol/L AZD6244+0.5μ mol/L GDC-0941)及聯(lián)合Ⅱ組(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。細胞經(jīng)過不

7、同組合濃度的抑制劑作用后，MTT法繪制增殖抑制曲線;平板集落形成法檢測集落形成能力的改變;流式細胞儀檢測細胞凋亡率及周期分布;Western blot檢測不同組中抑制劑靶點下游周期及凋亡相關(guān)蛋白表達的差異。
　　 在兩株NSCLC細胞中，單獨抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果較差。抑制劑AZD6244或GDC-0941作用于A549細胞的抑制率分別可達25.5％和38.1％，作用于NCI-H157

8、細胞的抑制率分別可達16.9％和35.1％。Westernblot結(jié)果顯示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后（降低pERK活化）激活PI3K/AKT/mTOR通路（增強pAKT活化）。相反，GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。結(jié)果表明單通路突變的細胞，僅抑制該突變通路，效果差。未突變通路的抑制劑對肺癌細胞的增殖也有抑制作用。無論肺癌細胞是KRAS單突變，還是KRAS/PTEN

9、雙突變，單通路抑制效果較差，需要雙通路聯(lián)合抑制提高療效。
　　 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR雙通路聯(lián)合抑制可增強KRAS/PTEN雙突變的NSCLC細胞的生長抑制作用。在NCI-H157細胞中，低劑量的聯(lián)合Ⅰ組表現(xiàn)為兩藥協(xié)同作用（q值=1.22），高劑量的聯(lián)合Ⅱ組表現(xiàn)為兩藥相加作用（q值=0.92）;集落形成能力下降[77.2±1.54個/孔VS61.5±2.12個/孔，P＜0.01]和[51±4個/孔VS

10、22.5±3.53個/孔，P＜0.01];凋亡率增加[18.3±0.82％ VS21.32±0.56％，P＜0.01]和[27.14±1.58％ VS42.45±4.42％，P＜0.01];細胞周期分布發(fā)生改變，聯(lián)合抑制組G0/G1期細胞增加，S期明顯減少(P＜0.01)。Western blot顯示，聯(lián)合抑制組與PI3K單獨抑制組相比，CyclinD1，CyclinB1表達量減少，P21表達量和PARP剪切增加，Bcl-2/Bax的比

11、值下降。表明雙通路聯(lián)合抑制，可降低劑量，增強藥效。
　　 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR雙通路聯(lián)合抑制亦可增強KRAS單突變的NSCLC細胞的生長抑制作用。但是由于兩條通路的相互制衡作用，藥效受兩通路相對抑制情況的影響。在A549細胞中，聯(lián)合Ⅰ組與低劑量的PI3K單獨抑制組相比，兩抑制劑表現(xiàn)為拮抗作用(q=0.58)，對肺癌細胞的增殖抑制作用未見增強，反而刺激了細胞的生長，集落形成能力[114.5±3.53個

12、/孔VS133±4.24個/孔，P＜0.01]，細胞周期的分布及凋亡率無明顯差異。聯(lián)合Ⅱ組與高劑量PI3K抑制組相比，兩抑制劑表現(xiàn)為相加作用(q=0.90)，細胞的增殖抑制作用出現(xiàn)了明顯增強，集落形成能力明顯下降[75.5±3.53個/孔VS50.5±4.94個/孔，P＜0.01];凋亡率顯著增加[37.85±3.18％ VS52.27±4.36％，P＜0.01]，細胞周期分布發(fā)生改變，聯(lián)合抑制組G0/G1期細胞增加，S期明顯減少(P＜

13、0.01)。Western blot顯示，CyclinD1，CyclinB1表達量減少，PARP剪切增加，Bcl-2/Bax的比值下降。
　　 總之，RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR雙通路聯(lián)合抑制可使KRAS單突變和KRAS/PTEN雙突變的NSCLC細胞的治療獲益，尤其是在KRAS/PTEN雙突變NSCLC細胞中表現(xiàn)為協(xié)同作用。但是對于KRAS單突變NSCLC細胞，聯(lián)合抑制效果受到藥物劑量和相關(guān)信號通路中基因