大鼠脊髓機械性損傷后iNOS的變化與細胞凋亡的關系及其法醫(yī)學意義.pdf

1、目的：脊髓損傷(spinal cord injury)是臨床及法醫(yī)學中常見的致死、致殘性損傷,主要由交通事故、高空墜落、重物砸傷等致病因素引起。脊髓的損傷可以造成損傷平面以下運動、感覺、自主神經功能障礙,是一種嚴重影響人類健康和生活質量的致殘性損傷,因此對神經細胞死亡及功能修復機理的研究具有十分重要的意義。此外,雖然脊髓損傷致死的案件在法醫(yī)實踐中時常見到,但目前尚無推斷脊髓損傷時間的確切方法,為尋求更加準確可靠的檢測方法,越來越多的學者

2、將分子生物學技術運用到法醫(yī)學研究中。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是一種非鈣離子/鈣調蛋白依賴性酶,是一氧化氮合酶(NOS)的一種亞型。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)在正常生理情況下較少表達,但當機體出現(xiàn)炎癥、氧化反應時,iNOS將起關鍵作用,iNOS也是誘導遲發(fā)性細胞凋亡的主要因子。Sinz運用RT-PCR檢測誘導型一氧化氮合酶的mRNA在外傷性腦損傷動物模型中的變化,發(fā)現(xiàn)iNOS在傷后的表達存在一定的時序性規(guī)律。查閱國內外文獻,在動

3、物脊髓損傷模型中關于iNOS的研究比較少見。細胞凋亡(apoptosis)是程序性細胞死亡,是一種正常的積極主動的生理過程,首先細胞接收、識別某種特殊生理或病理性信號,然后啟動細胞凋亡特有的基因,再通過mRNA的轉錄合成某種有致死效應的蛋白質,最終導致了細胞的解體、死亡、形成凋亡小體。近年來切斷神經細胞凋亡的途徑成為減少神經細胞凋亡以及恢復神經功能的研究熱點。李興彪等研究表明閉合性小腦挫傷后不同損傷時間細胞凋亡指數(shù)的變化可以為法醫(yī)學早期

4、損傷時間推斷提供客觀的實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴將54只成年雌性SD大鼠隨機分為對照組和8個實驗組,每組6只。實驗組按3小時、6小時、12小時、1天、3天、5天、7天、14天8個時間點分組。⑵采用自制改良的Allen's打擊設備,制作脊髓機械性損傷模型。記錄損傷后大鼠行為學變化,在相應的時間點處死大鼠取出損傷段脊髓。⑶觀察各實驗組病理變化;采用免疫組織化學技術檢測各大鼠脊髓中iNOS的表達情況:采用原位末端轉移酶標記技術(TUN

5、EL)檢測脊髓細胞凋亡的表達情況。⑷所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(-x±s)表達,采用SPSS12.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,組間比較采用單因素方差分析方法,組內比較采用配對T檢驗(LsD-t),檢驗水準α=0.05。
　　 結果：①大鼠脊髓組織HE染色結果:對照組脊髓灰質及白質分界清晰,神經元細胞核大著色均勻。各實驗組病理改變不同:損傷早期(3h-3d)脊髓實質內可見出血點;神經元腫脹,體積增大,核膜不清,周圍出現(xiàn)空隙;毛細血管擴張充

6、血,炎細胞附壁。損傷3d以后可見脊髓組織疏松,神經元數(shù)量減少,膠質細胞反應性增生,14d組織損傷處灰白質分界漸清,水腫及出血消失,有炎細胞浸潤,纖維組織增生。②免疫組化檢測iNOS陽性細胞表達結果:對照組:僅見少量iNOS陽性細胞。各實驗組:損傷后各實驗組灰質內iNOS陽性細胞表達明顯多于白質,損傷后3h即有表達,3d表達較強,7d達到高峰,14d組表達明顯下降。各損傷組與對照組比較,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。③TUNEL

7、檢測細胞凋亡結果:對照組:未見細胞凋亡;實驗組:3h、6h組未見細胞凋亡,12h可見極少量細胞凋亡,3d、5d表達逐漸增強,7d達到高峰,14d明顯減少。早期凋亡細胞主要集中于損傷部位,高峰期損傷周圍亦可見凋亡細胞。各損傷組與對照組比較,其差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論：⑴實驗利用自制設備成功制作了大鼠脊髓機械性損傷模型,符合人體損傷的實際情況,達到了實驗要求。⑵成年大鼠在脊髓急性機械性損傷刺激下,誘導型一氧