水蛭DNA鑒定、活性多肽分離及其作用機制的研究.pdf

1、廣義水蛭通常是指環(huán)節(jié)動物門(Annelida)蛭綱(Hirudinea)一類動物的總稱。作為中藥，從《神農本草經》開始記載使用，迄今已有3000多年的歷史。中醫(yī)對瘀血的定義是指體內血液停積而形成的病理產物，凡能影響血液正常運行，引血液運行不暢，致血離經脈而瘀積的內外因素，均可導致瘀血形成。中醫(yī)論述水蛭的性味、功效和主治為：味咸平，可破血、逐瘀、通經，治蓄血、癥瘕積聚、婦女經閉、干血成癆、跌撲損傷等證。水蛭的功效與其抗凝血作用密切相關。凝

2、血是機體重要的生理防御過程，但病理性凝血即血栓形成導致血行不暢，在心腦血管疾病的惡化中起著關鍵的作用，因此，抗血栓和抗凝血是治療心腦血管疾病的重要方法之一。水蛭中發(fā)現的最重要的、療效最好的抗凝血活性物質是水蛭素（Hirudin），水蛭素是迄今發(fā)現的最強的凝血酶抑制劑。
　　水蛭作為中藥，中醫(yī)臨床使用歷史悠久，其活血化瘀功效確切，但仍有很多中醫(yī)藥用的基礎理論問題尚未研究清楚。如1、藥用品種問題。中國藥典中藥水蛭的來源僅有三種，廣義水

3、蛭是環(huán)節(jié)動物門蛭綱動物的總稱，有什么較好的辦法能將形態(tài)類似的動物加以區(qū)分，以保證中藥水蛭的品種來源及臨床療效？2、療效藥用物質基礎問題。水蛭素等活性物質只能在活體的日本醫(yī)蛭分泌物中提取，干燥和加熱后就會受到破壞。而中醫(yī)臨床藥用水蛭使用其干燥體，用水煎煮甚至炮制后服用，這是否還具有活血化瘀或抗凝血作用？在不吸血的寬體金線蛭中并不含水蛭素，寬體金線蛭作為中藥水蛭的主流商品，是否含有抗凝血的活性物質？其抗凝血活性成分有哪些？其抗凝血作用機制與

4、哪些因素相關？3、資源緊張問題。近年來市場需求不斷上漲，中藥水蛭尤其是日本醫(yī)蛭的資源極度緊缺，究竟古代藥用水蛭品種與現代藥用品種有什么不同？什么水蛭的品種可作為新的水蛭資源品種進行替代研究？4、質量評價問題?？鼓钚允侵兴幩位钛龉πУ乃幚韺W基礎，但目前中國藥典中水蛭抗凝血活性的測定方法穩(wěn)定性和準確性欠佳，期待尋找更為合理的方法用于檢測水蛭藥材的抗凝血活性，以確保其臨床療效。這些都是中藥水蛭在臨床應用中所亟待解決的中醫(yī)基礎理論問題

5、。
　　為研究上述問題，本文在不同物種水蛭的分子生物學鑒定；在寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭及菲牛蛭抗凝活性成分的分析、分離及鑒定；在寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭及菲牛蛭的抗凝血體外作用機制初探；在抗凝血活性的生物檢定等方面，進行了廣泛而深入的研究。通過研究，發(fā)現了一些新的抗凝血活性肽及其作用機制，尤其在寬體金線蛭的研究方面，較前人有較多新的進展。
　　采用分子生物學技術，擴增得到寬體金線蛭、菲牛蛭、日本醫(yī)蛭、尖細金線蛭、光潤金線蛭、棒紋牛蛭

6、、日本山蛭及八目石蛭等8個物種的ITS2、COⅠ、12SrRNA、16SrRNA等基因片斷的序列，比較此4個基因片斷候選序列種內種間差異；利用Wilcoxon Two Sample Tests檢驗，考察候選序列種間、種內變異的barcoding gap；并結合鑒定成功率，得到12SrRNA為醫(yī)用蛭類較為合適的DNA條形碼序列。并提出應用COⅠ及12SrRNA聯合序列在種內保守而種間差異較大的片段設計特異引物，是準確鑒別水蛭藥材真?zhèn)蔚睦硐?/p>

7、方法。
　　采用凝膠柱色譜聯合制備高效液相色譜的方法，依據中醫(yī)臨床的使用特點，首次從寬體金線蛭中分離得到一個耐熱、具抗凝血活性的多肽成分，分子量為9374，并分析其含分子量為1832的糖鏈，屬于糖肽類化合物，對寬體金線蛭藥效物質基礎有了初步的闡釋。
　　用液質聯用的方法，對日本醫(yī)蛭及菲牛蛭中抗凝血活性多肽類成分進行了研究，分析得到日本醫(yī)蛭3個多肽類成分，分子量為14998、15988、15956；菲牛蛭中分析得到6個多肽類成

8、分，9590、13642、14998、17631、15988、16567。其中日本醫(yī)蛭與菲牛蛭有兩個成分具有相同的分子量，且此兩成分為活性多肽部位主要的成分峰。從活性成分角度而言，菲牛蛭作為水蛭新來源是完全可以的。用胰蛋白酶酶切結合MarkerLnyx軟件分析的方法，找到日本醫(yī)蛭與菲牛蛭區(qū)別的特征識別肽。
　　采用體外培養(yǎng)結合液質聯用的方法，分析了寬體金線蛭與凝血酶、凝血因子Ⅶ以及凝血因子Ⅸ的作用，初步認為寬體金線蛭抗凝血作用位點

9、與凝血因子Ⅶ有關；對比了寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛蛭及棒紋牛蛭與凝血酶的作用，認為后三者均與凝血酶有作用，但寬體金線蛭抗凝血作用位點是與凝血酶、凝血因子Ⅶ等多個位點相關，體現了水蛭作用多靶點整體性的特點，這一特點既符合中醫(yī)整體觀念，又符合中藥多成分多靶點作用模式。
　　將生物檢定技術應用于水蛭抗凝血活性的測定，探討反映水蛭生物活性的質量控制方法。采用肝素鈉作為對照品，選擇APTT值作為抗凝活性評價依據，對寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、菲牛

10、蛭、棒紋牛蛭的抗凝活性進行測定，測定結果分別用標準曲線法和生物檢定統(tǒng)計法計算。4種水蛭APTT法的量效關系曲線與肝素的量效關系曲線類似，突躍范圍呈平行關系，上述特點符合生物檢定的要求，說明以肝素鈉作為標準品，采用生物檢定技術APTT法測定水蛭等樣品的抗凝活性是可行的。APTT值可以全面反映水蛭的抗凝血作用，測定結果對臨床使用更具指導意義。生物檢定技術應用于中藥質量評價，符合中醫(yī)整體作用、協(xié)同作用的觀點，是對現有中藥質量標準控制方法良好的

11、補充。
　　本文通過研究，整合DNA分子標記技術、LC-MS色譜聯用技術、生物檢定技術等現代分析手段，使用各種計算機軟件系統(tǒng)作數據分析處理，分別從鑒定、分離、分析、質量評價等方面構建了含動物活性多肽類的中藥研究的先進技術平臺，為動物類中藥的研究建立了一個系統(tǒng)研究的模式；突出了生物檢測技術作為中藥質量評價與控制的發(fā)展方向，采用同一APTT法評價不同活性強度不同水蛭品種的抗凝活性，解決了水蛭原有的凝血酶滴定法對不同品種測定評價方法不統(tǒng)