腫瘤相關microRNA及基因在胃腸道間質瘤中表達的臨床意義及其分子機制研究.pdf

1、[目的]結合小樣本高通量芯片篩選、生物信息學分析及臨床組織樣本驗證，研究腫瘤相關微小核糖核酸（microRNA，miRNA）及基因在不同危險度分級的胃腸道間質瘤（gastrointestinalstromaltumor,GIST）組織中的差異表達，評估候選miRNA及基因對GIST臨床病理分級及預后判斷的臨床價值，探討其對GIST細胞生物學功能的影響及作用機制;研究神經遞質系統在胃腸道間質瘤中的表達情況，探討神經遞質系統相關分子在GIS

2、T組織中表達的臨床意義及其分子機制，為提高GIST的臨床診斷水平尋找新的突破點，為開發(fā)GIST治療的新靶點提供實驗和理論依據。
　　[方法](1)應用miRCURYTMLNAArraymicroRNA表達譜芯片分析12例不同危險度GIST組織標本中microRNA差異表達譜，利用生物信息學技術對篩選出的microRNA進行功能分析，并對候選microRNAmiR-193a-3p的靶基因進行預測;應用Taqman(R)qPCR法在福

3、爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixedparaffin-embedded，FFPE)的GIST組織與配對腫瘤旁組織中檢測miR-193a-3p的表達量，分析其在腫瘤與正常組織及不同危險度腫瘤組織中的表達差異，并分析其與患者術后生存及腫瘤復發(fā)的關系。利用體外細胞實驗研究技術與方法，以瞬時轉染mimicmiR-193a-3p的GIST882細胞作為研究對象，探索miR-193a-3p對GIST882細胞增殖、凋亡、遷移與侵襲等生物

4、學功能的影響;利用qPCR、western-blot及熒光素酶報告基因的手段驗證miR-193a-3p對于靶基因KIT調控作用及其對相關下游信號通路的影響;通過建立GIST皮下成瘤裸鼠動物模型;鑒定miR-193a-3p對GIST882細胞體內成瘤能力的影響，通過體外細胞藥物敏感性實驗，檢測miR-193a-3p對于GIST靶向藥物甲磺酸伊馬替尼(Imatinibmesylate，IM)作用的影響，評估其對GIST的潛在治療作用;(2)

5、應用NimbleGenTMmicroarray分析12例不同危險度GIST組織標本中差異基因表達譜，聯合高通量表達數據庫(GeneExpressionOmnbius，GEO)分析篩選與GIST危險度相關的差異基因，并應用SYBR(R)GreenqPCR法在新鮮凍存的GIST組織中驗證表達差異;構建GIST組織芯片并用免疫組織化學方法驗證篩選出的差異基因胞環(huán)蛋白肌動蛋白結合蛋白（Anillin，ANLN）在GIST組織中的表達及其臨床意義

6、;(3)利用GIST表達譜芯片及組織芯片研究神經遞質系統相關分子在胃腸道間質瘤中的表達情況，探討乙酰膽堿酯酶在胃腸道間質瘤組織樣本中的表達及其臨床意義，通過體外細胞實驗研究神經遞質乙酰膽堿及乙酰膽堿酯酶抑制劑對GIST882細胞增殖的影響。
　　[結果](1)microRNA表達譜芯片在12例不同危險度GIST中篩選出27個與GIST危險度相關的microRNA，通過生物信息學技術，結合Targetscan、miRanda、Pic

7、tar軟件分析預測其中的miR-193a-3p可能以KIT為靶基因;在20對FFPE的GIST組織及配對腫瘤旁組織中的驗證發(fā)現miR-193a-3p在GIST組織中的表達量低于正常組織，存在統計學差異(P=0.0205)，進一步擴大樣本量，對94例不同危險度分級的GIST組織檢測miR-193a-3p的表達量，發(fā)現miR-193a-3p的表達量隨著GIST腫瘤危險度的升高而下調(P=0.0145);miR-193a-3p在GIST中的表

8、達高低與性別、年齡、腫瘤部位無顯著相關性，但與腫瘤大小(P=0.006)、核分裂相(P=0.004)及危險度分級(P＜0.001)顯著負相關，同時miR-193a-3p表達與KIT表達強度呈負相關(P=0.003);miR-193a-3p低表達組的5年無復發(fā)生存率顯著低于高表達組(30％vs72.1％，P=0.001)，同時miR-193a-3p低表達組的5年總生存率也顯著低于高表達組(63.7％vs85.6％，P=0.047);體外細

9、胞功能實驗發(fā)現外源性miR-193a-3p可以顯著抑制GIST882細胞的增殖，從96h起即有顯著差異;同時miR-193a-3p可抑制GIST882細胞遷移及侵襲的能力，遷移實驗(Transwell)結果顯示mimicmiR-193a-3p組的穿透細胞數（14.40±1.208/高倍鏡視野）顯著低于mimicNC組（49.40±2.750/高倍鏡視野）(P＜0.0001)，侵襲實驗(Transwell)結果顯示mimicmiR-193

10、a-3p組的穿透細胞數（19.80±1.020/高倍鏡視野）同樣顯著低于mimicNC組（38.60±0.871/高倍鏡視野）(P＜0.0001);利用流式細胞儀檢測miR-193a-3p對GIST882細胞凋亡的影響，發(fā)現mimicmiR-193a-3p組細胞凋亡率13.63±0.45％，而mimieNC組為3.753±0.29％，兩者存在顯著差異(P=0.0044);裸鼠皮下成瘤實驗發(fā)現注射Agomir（經化學修飾的穩(wěn)定miRNA激

11、動劑）miR-193a-3p的GIST皮下移植腫瘤體積與AgomirNC組比較明顯縮小，注射10天后即有顯著差異，注射30天后收獲皮下腫瘤，發(fā)現AgomirmiR-193a-3p組皮下腫瘤質量顯著小于AgomirNC組(0.0778gvs0.2252g，P＜0.001)。利用qPCR、western-blot和熒光素酶報告基因手段證實miR-193a-3p以KIT基因為靶基因并對其直接調控，發(fā)現miR-193a-3p與NC相比可以顯著抑

12、制熒光素酶的活性(P＜0.01)，對轉染了mimicmiR-193a-3p48h后的GIST882與NC組進行比較，發(fā)現其KITmRNA表達下降了53.1％，KIT蛋白表達水平下降了67％;此外miR-193a-3p同時抑制KIT相關下游信號通路主要分子(AKT，MAPK，STAT3)的激活，AKT磷酸化水平下降了33％，MAPK磷酸化水平下降了13％，STAT3磷酸化水平下降了43％;通過體外細胞藥物敏感性實驗，發(fā)現mimicmiR-

13、193a-3p組對IM的IC50濃度(0.312uM)明顯低于mimicNC組(1.345uM)，兩者存在顯著差異(P＜0.05);(2)利用基因表達譜芯片及GEO數據庫芯片結果篩選出可能與GIST危險度相關的10個編碼基因，利用qPCR在36例不同危險度分級的GIST新鮮冰凍組織中驗證其中四個基因ANLN、DPP4、PEG10、SPP1的表達量，發(fā)現ANLN與DPP4的表達量在高危GIST中明顯上調，具有統計學差異（P值分別0.016

14、與0.03）。通過在包含326例GIST組織的組織芯片中對ANLN進行免疫組化檢測發(fā)現ANLN在GIST中顯著高表達，ANLN表達強度與腫瘤部位存在密切關聯(P＜0.001)，并與腫瘤直徑(P＜0.001)、核分裂相(P=0.001)和腫瘤分級(P＜0.001)呈正相關，ANLN高表達組的5年無復發(fā)生存率顯著低于低表達組(64.6％vs85.6％，P＜0.001)，同時ANLN高表達組的5年總生存率也顯著低于低表達組(77.5％vs97

15、.4％，P=0.003);3)通過對GIST表達譜芯片的分析，發(fā)現大多數神經遞質系統相關基因在GIST組織中存在恒定表達，通過在包含326例GIST組織的組織芯片中對重要神經遞質系統分子乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACHE）進行免疫組化檢測發(fā)現ACHE表達強度與腫瘤部位存在密切關聯(P＜0.001)，與腫瘤大小(P＜0.001)及危險度分級(P＜0.001)正相關，ACHE高表達組5年總生存率顯著低于低表達組

16、(83.4％vs91％，P=0.033)，ACHE高表達組5年無復發(fā)生存率也顯著低于低表達組(81.4％vs67.8％，P=0.026)。使用不同濃度梯度的乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)及乙酰膽堿酯酶抑制劑新斯的明(Neostigmine，Neo)處理GIST882細胞，發(fā)現Ach及Neo都能夠顯著抑制GIST882細胞的增殖能力，96h后即有統計學差異。
　　[結論](1)miR-193a-3p在GIST組織中顯

17、著低表達，且其表達量與GIST危險度分級、腫瘤大小、核分裂相密切相關，與KIT表達強度負相關，miR-193a-3p低表達提示GIST患者總生存率及無復發(fā)生存率低;外源性miR-193a-3p可以顯著抑制GIST882細胞增殖、遷移及侵襲能力，促進細胞凋亡，并在體內抑制GIST882細胞成瘤性;miR-193a-3p能夠直接負調控靶基因KIT表達，并抑制KIT相關下游信號通路的激活，同時miR-193a-3p能夠顯著提高GIST882細

18、胞對靶向藥物IM的敏感性。(2)胞環(huán)蛋白肌動蛋白結合蛋白（Anillin,ANLN）在高危GIST中表達量明顯上調，其表達與GIST臨床病理特征及預后密切相關，并可能用于輔助評估GIST患者術后復發(fā)轉移風險及預后。(3)乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACHE）表達與GIST臨床病理特征及預后密切相關，并可能用于輔助評估GIST患者術后復發(fā)轉移風險及預后，乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)及乙酰膽堿酯