含人MxA基因重組腺病毒抗乙型肝炎病毒作用研究.pdf

1、第一部分：人類MxA基因的克隆與序列分析。 目的：從健康中國人外周血單個核細胞中克隆人類MxA基因，為下一步構建重組腺病毒打下基礎。 方法：從健康中國人外周血單個核細胞中提取總RNA，以總RNA為模板，根據(jù)GenBank中的MxA序列設計合成擴增MxA基因的特異性引物，進行RT-PCR反應擴增出目的基因。目的基因經純化后定向克隆至腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV，構建重組質粒pAdTrack-MxA，選取鑒定正確的

2、克隆測序，并應用DNASIS2．1軟件對序列與已知GenBank中的MxA基因序列進行同源性分析。 結果：重組質粒pAdTrack-MxA構建成功，測序結果表明本實驗所克隆片段長2012bp，包含人MxA基因序列。分析表明與GenBank中人MxA基因序列同源性達99．75％，僅有5個堿基不同，且所編碼的氨基酸僅1個發(fā)生改變，此氨基酸位于MxA蛋白的非功能區(qū)。 結論：我們成功克隆了中國人MxA基因，同源性分析表明，可以以

3、此為模板，構建重組腺病毒。 第二部分：含人MxA基因重組腺病毒質粒的構建。 目的：在成功克隆人類MxA基因的基礎上，應用腺病毒載體系統(tǒng)AdEasysystem構建重組腺病毒質粒pAdMxA。 方法：先將重組質粒pAdTrack-MxA擴增，以堿裂解法提取質粒，以PmeI酶切使之線性化后與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1在BJ5183細菌內進行同源重組以構建重組腺病毒質粒pAdMxA。重組腺病毒質粒pAdMxA經卡

4、那霉素抗性鑒別和PacI酶切確證，然后將pAdMxA以PmeI線性化后轉染入293細胞中包裝成完整的重組腺病毒顆粒AdMxA，觀察綠色熒光蛋白的表達并檢測重組腺病毒AdMxA的感染滴度。 結果：重組腺病毒質粒pAdMxA經PacI酶切后可見一條約4．Skb和另一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。重組腺病毒質粒pAdMxA經293細胞包裝后可觀察到綠色熒光，收獲病毒并測定感染滴度為1．59×108(pfu／m1)，具有較高感染

5、效率。 結論：重組腺病毒AdMxA構建成功，為下一步進行慢性HBV感染的基因治療等研究奠定了基礎。 第三部分：重組腺病毒AdMxA抗HBV初步研究 目的：研究重組腺病毒AdMxA體外抗HBV作用效果，為后續(xù)體內實驗研究提供實驗和理論基礎。 方法：1．以重組腺病毒AdMxA的不同MOI轉染HepG2．2．15細胞，利用RT-PCR方法檢測HepG2．2．15細胞內MxAmRNA水平的表達。 2．以重

6、組腺病毒AdMxA的不同MOI轉染HepG2．2．15細胞，利用ELASE方法檢測HepG2．2．15細胞內HBsAg、HBeAg水平的變化。 結果： 1．RT—PCR結果：HepG2．2．15細胞經重組腺病毒AdMxA轉染后，胞內MxAmRNA水平均較未轉染對照組明顯升高。 2．ELASE檢測結果：HepG2．2．15細胞經重組腺病毒AdMxA轉染后，胞內HBsAg、HBeAg水平均較未轉染對照組明顯降低，有統(tǒng)