Bevacizumab靶向治療卵巢癌及其對SKOV3細(xì)胞VEGF自分泌通路的抑制.pdf

1、1.目的：
　　1）VEGF及其受體VEGFR1（Flt-1）、VEGFR2（KDR）在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系；
　　2）SKOV3細(xì)胞VEGF自分泌現(xiàn)象及Bevacizumab對其增殖的抑制作用研究。
　　2.方法：
　　1）VEGF及其受體VEGFR1、VEGFR2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及與臨床預(yù)后研究：
　　（1）正常卵巢、良性上皮性卵巢腫瘤及上皮性卵巢癌組織中VEGF、VEGF

2、R1及VEGFR2的表達(dá)差異；
　　（2）上皮性卵巢癌組織中VEGF及VEGFR1、VEGFR2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；
　?。?）VEGF及VEGFR1、VEGFR2三者陽性表達(dá)之間的相關(guān)性；
　?。?）VEGF及VEGFR1、VEGFR2三者共高表達(dá)與非共高表達(dá)5年生存率比較。
　　2）上皮性卵巢癌細(xì)胞中VEGF自分泌機(jī)制研究：
　　（1）對比及篩選上皮性卵巢癌細(xì)胞系中VEGF、VEGFR1（F

3、lt-1）、VEGFR2（KDR）的表達(dá)差異；
　　（2）檢測不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)基血清中VEGF含量；
　?。?）外源加入不同濃度rhVEGF檢測篩選后細(xì)胞系增殖情況；
　　（4）驗證細(xì)胞自分泌途徑主要結(jié)合VEGFR2（KDR）分泌機(jī)制。
　　3）Bevacizumab（Bev）對上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖影響及機(jī)制研究：
　?。?)鏡下觀察各種Bev濃度梯度下作用SKOV3細(xì)胞24h后細(xì)胞輪廓改變情況；
　

4、　（2)MTT法檢測不同濃度Bev及對照組細(xì)胞的增殖情況；
　?。?) Annexin-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；
　?。?)WB分析不同濃度Bev作用SKOV3后Flt-1、KDR及p-KDR表達(dá)變化；
　　（5）通過Ki8751選擇性抑制KDR受體，初步推斷其下游ERK可能參與Bev直接抑制SKOV3細(xì)胞自分泌通路。
　　3.結(jié)果：
　　1)VEGF及其受體VEGFR1、VEGFR2在

5、上皮性卵巢癌組織中的染色強(qiáng)度明顯高于良性卵巢腫瘤及正常卵巢上皮；并且VEGF及其受體在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)與臨床分期及腹水量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；在相關(guān)分析中高表達(dá)的 VEGF與VEGFR2（r=0.316,p<0.05）、VEGFR1與VEGFR2（r=0.415,p<0.05）均存在相關(guān)性；VEGF及其受體的三者共高表達(dá)較非共高表達(dá)患者的5年生存率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p=0.044）。
　　2）人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中存在

6、VEGF及其受體Flt-1、KDR的共表達(dá)及相對高表達(dá)（p<0.05），不同濃度的 rhVEGF對卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3有促進(jìn)增殖作用，且隨著濃度梯度的遞增，增殖成正比，初步推斷該過程可能由 KDR介導(dǎo)（t=7.64;t=5.53; t=4.22; t=6.59,p<0.05;），而非Flt-1介導(dǎo)（t=2.05; t=2.34; t=1.32，p>0.05），同時外源性rhVEGF可刺激SKOV3細(xì)胞VEGFR2（KDR）（t=5.

7、81，*P<0.05）及p-VEGFR2(p-KDR)（t=12.43，*P<0.05）的表達(dá)增高，提示卵巢癌細(xì)胞株 VEGF的自分泌機(jī)制主要通過KDR介導(dǎo)，而非Flt-1，并通過磷酸化受體p-KDR激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。
　　3）不同濃度 Bevacizumab對卵巢癌細(xì)胞株 SKOV3有抑制增殖、增加凋亡作用（*P<0.05）； WB結(jié)果提示Bev以上的作用可能與阻斷VEGF自分泌環(huán)路有關(guān)，即降低相應(yīng)受體 VEGFR2

8、（KDR）/p-VEGFR2(p-KDR)的表達(dá)(*P<0.05)，而非VEGFR1（Flt-1）（P>0.05）。此外，erk及p-erk分子在Bev、Ki8751（VEGFR2抑制劑）及 Bev+Ki8751組中的表達(dá)明顯較空白對照組顯著減少（*P<0.05），提示Bevacizumab可能通過間接抑制VEGFR2下游信號通路中erk及p-erk的表達(dá)而抑制細(xì)胞VEGF自分泌功能，進(jìn)一步抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。
　　4.結(jié)論：<

9、br>　　1）VEGF及VEGFR1、VEGFR2在上皮性卵巢癌組織中顯著高表達(dá)，且高表達(dá)VEGF的卵巢癌更易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，VEGF及VEGFR1和VEGFR2與腫瘤分期、腹水產(chǎn)生有著密切關(guān)系。預(yù)后分析中共高表達(dá)VEGF及其受體VEGFR1和VEGFR2的患者預(yù)后較差，VEGF及其受體VEGFR1、VEGFR2三者共高表達(dá)不僅可作為卵巢癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)，也可成為抗腫瘤血管生成靶向治療療效的預(yù)測指標(biāo)，即貝伐珠單抗應(yīng)用于三者共高表達(dá)的患

10、者較三者不表達(dá)或低表達(dá)的患者可能具有更佳的治療效果。
　　2）人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中存在VEGF自分泌機(jī)制，rhVEGF對SKOV3有促增殖作用，也使腫瘤細(xì)胞表面受體 KDR及 p-KDR表達(dá)增高。VEGF可激活胞內(nèi)p-KDR，進(jìn)一步活化自分泌環(huán)路的下游信號。
　　3）Bevacizumab通過阻斷SKOV3細(xì)胞VEGF自分泌環(huán)路而降低表面受體KDR及p-KDR的表達(dá)，同時Bevacizumab可能通過間接抑制KDR下游