番木瓜環(huán)斑病毒HC-Pro、NIb和CP基因的原核表達及其抗體制備.pdf

1、番木瓜環(huán)斑病毒(Papayaringspotvirus,PRSV)是馬鈴薯Y病毒屬的典型成員，是番木瓜病害中的主要病原，造成世界番木瓜生產(chǎn)上的主要損失。PRSV是由單一ORF編碼的，多聚蛋白表達后再分解成各個功能蛋白。本文對采自福建農(nóng)林大學校區(qū)的被PRSV感染的番木瓜病葉樣本進行研究。對PRSV中的HC-Pro、NIb和CP編碼基因進行擴增克隆、原核表達、GST融合蛋白抗體制備和系統(tǒng)進化分析及基本生物信息學分析。 通過Trizo

2、l法提取PRSV的總RNA。根據(jù)臺灣的YK分離物、美國夏威夷的HA分離物、墨西哥分離物、泰國分離物的基因組全長中的較保守序列區(qū)域分別設計引物，通過RT-PCR方法擴增出特異性目的條帶。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉化DH5α大腸桿菌克隆至pMD18-T載體上，經(jīng)藍白斑和氨芐青霉素抗性篩選和雙酶切法鑒定，分別獲得了重組質粒pMD-HC、pMD-NIb和pMD-CP。再經(jīng)過雙酶切，把目的基因連接到表達載體pGEX-4T-1上，分別獲得了pG

3、EX-4T-HC、pGEX-4T-NIb和pGEX-4T-CP重組表達質粒，并對它們進行了序列測定和分析。經(jīng)過BLAST程序比對，HC-Pro的核苷酸序列與臺灣的YK分離物(X97251)的HC-Pro在核苷酸水平上同源性最高，達到90.63％，在氨基酸水平上與泰國的PRSV-P株系(AAO16605)同源性為97.82％。NIb的核苷酸和序列與中國華南SM分離物(X96538S76059)同源性最高，達到90％，在氨基酸水平上與泰國的

4、PRSV-W株系(AAG47346)同源性最高，達到95％。CP基因的核苷酸序列與一個登錄號為D50591的日本分離物同源性最高，達到95％。在氨基酸水平上與一個登錄號為PAA016605泰國的泰國分離物同源性最高，達到93％。另外，在CP、NIb和CP蛋白的氨基酸水平上構建了系統(tǒng)進化樹，結果表明我國福建本地的PRSV與泰國分離物的PRSV的親緣關系較近。 本文利用pGEX-4T-1的GST標簽進行目的蛋白的融合表達，分別構建了