活血補(bǔ)腎湯對(duì)激素性股骨頭壞死VEGF及OPG-RANKL表達(dá)的影響.pdf

1、研究目的:
　　 本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法,從組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分子水平,研究活血補(bǔ)腎湯對(duì)VEGF及OPG、RANKL的表達(dá)的影響,探討激素性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制及活血補(bǔ)腎湯治療激素性股骨頭壞死的作用機(jī)制,為活血補(bǔ)腎湯的治則治法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.活血補(bǔ)腎湯對(duì)兔激素性股骨頭壞死VEGF的影響
　　 1.1、將130只新西蘭大白兔分為5組:正常對(duì)照組、激素模型組、高(12.8

2、8g/kg·d)、中(9.66g/kg·d)、低(6.44g/kg·d)劑量活血補(bǔ)腎湯中藥治療組(造模按Matsui造模法)。正常對(duì)照組及激素模型組每日生理鹽水10ml灌胃。中藥治療組每日給予不同濃度的活血補(bǔ)腎湯中藥灌胃。連續(xù)給藥后,于第4、8、12周分批取材。
　　 1.2、顯微鏡下觀察各組兔股骨頭的組織形態(tài)并空骨陷窩記數(shù)。
　　 1.3、采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的測(cè)定。
　　 2

3、.活血補(bǔ)腎湯對(duì)兔激素性股骨頭壞死血清OPG/RANKL的影響。
　　 2.1、動(dòng)物分組、造模、給藥同上。
　　 2.2、給藥4、8、12周時(shí)每組各取8只大白兔腹主動(dòng)脈取血3ml,離心后收集血清,保存?zhèn)溆谩?br>　　 2.3、采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)兔血清OPG、RANKL含量。
　　 3.活血補(bǔ)腎湯含藥血清對(duì)大鼠成骨細(xì)胞OPG/RANKLmRNA表達(dá)的影響。
　　 3.1、取新生SD大鼠

4、的顱蓋骨進(jìn)行成骨細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)。取3代生長(zhǎng)期成骨細(xì)胞,顯微鏡鏡下觀察進(jìn)行成骨細(xì)胞鑒定。
　　 3.2、 SD大鼠12只,分為4組(生理鹽水對(duì)照組、高、中、低劑量活血補(bǔ)腎湯中藥組),每組3只。對(duì)照組大鼠3ml生理鹽水灌胃,高、中、低劑量中藥組大鼠按不同濃度3ml活血補(bǔ)腎湯灌胃,每天兩次,連續(xù)3天。各組于末次灌胃后2小時(shí)股動(dòng)脈取血。離心后收集血清,保存?zhèn)溆谩?br>　　 3.3、大鼠成骨細(xì)胞分別置于含各組血清(濃度20％)的培

5、養(yǎng)基中,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 3.4、 RT-PCR方法對(duì)各組成骨細(xì)胞的OPG、RASKLmRNA表達(dá)進(jìn)行半定量檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.HE觀察：
　　 激素模型組:骨小梁稀疏、結(jié)構(gòu)紊亂,骨髓細(xì)胞大量減少,骨髓多被脂肪細(xì)胞填充,骨細(xì)胞數(shù)量減少,空骨陷窩增多；中藥治療組在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)的骨小梁結(jié)構(gòu)基本完整。高、中劑量中藥組第8、12周骨小梁表面形成新的骨細(xì)胞和骨組織。
　　 2.VEGF的表達(dá)

6、。
　　 第4周時(shí),高、中、低劑量中藥組及模型組VEGF表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。中、低劑量組VEGF表達(dá)高于模型組(P<0.05)；第8周時(shí),高、中、低劑量中藥組VEGF表達(dá)明顯高于模型組(P<0.01)；第12周時(shí),高、中、低劑量中藥組VEGF表達(dá)明顯高于模型組(P<0.01)。
　　 3.OPG、RANKL血清含量。
　　 第4周:高、中、低劑量中藥組、正常對(duì)照組OPG含量均顯著高于模型組(P

7、<0.01)。第8周:模型組OPG含量顯著低于高、中、低劑量中藥組及正常對(duì)照組(P<0.01)。高、中、低劑量組明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01).第12周:高、中、低劑量中藥組、正常對(duì)照組OPG含量均顯著高于模型組(P<0.01).模型組RASKL含量4、8、12周均顯著高于高、中、低劑量組及正常對(duì)照組(P<0.01)。
　　 4.成骨細(xì)胞OPG、RASKLmRNA表達(dá)值。
　　 高、中劑量中藥組OPGmRNA表達(dá)值高

8、于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05)。高、中、低劑量組之間無(wú)明顯差異。RANKLmRNA表達(dá)值:高、中劑量中藥組明顯低于生理鹽水對(duì)照組(P<0.01)。低劑量中藥組低于生理鹽水對(duì)照組(P<0.05)。高劑量中藥組低于低劑量中藥組(P<0.05).
　　 結(jié)論：
　　 1.激素性股骨頭壞死局部VEGF的表達(dá)降低,抑制了血管與骨的再生。
　　 2.活血補(bǔ)腎湯能夠增強(qiáng)壞死股骨頭局部VEGF的表達(dá)。
　　 3.激素性