膿毒癥時調節(jié)性T細胞通過膜依賴的TGF-β1促進效應性T細胞凋亡的研究.pdf

1、目的:Treg(CD4+CD25+T細胞)為機體內重要負性免疫調節(jié)細胞，膿毒癥時Treg功能增強，可能與脾臟內效應性T細胞的大量凋亡有關，在膿毒癥免疫紊亂發(fā)生中具有重要作用。資料表明，轉化生長因子β1(TGF-β1)在調節(jié)效應T細胞的分化、增殖和凋亡中具有直接作用，本研究旨在通過檢測膿毒癥小鼠脾臟Treg功能狀態(tài)以及體外共培養(yǎng)時對Teff(CD4+CD25-T細胞)凋亡的影響，分析TGF-β1在介導Treg促進Teff凋亡中的作用及相關

2、分子機制，為膿毒癥的免疫調理治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶標。
　　 方法:建立穩(wěn)定的小鼠盲腸結扎穿孔(CLP)模型，分別于術后24小時(h)、48h斷頸處死小鼠，無菌留取脾臟，免疫磁珠法分選CD4+CD25-T細胞(Teff)與Treg。流式細胞術檢測Treg表面TGF-β1、CTLA-4及胞內Foxp3的表達水平;RT-PCR法檢測Treg細胞內TGF-β1 mRNA水平。另外，用抗-CD3抗體(5μg/ml)和抗-CD28抗

3、體(5μg/ml)預孵育96孔培養(yǎng)板1h后，將CFSE標記的-Teff與Treg按照2∶1的比例進行混合培養(yǎng)(細胞濃度為1×106/ml):1.采用CCK-8和AnnexinV-PE法檢測共培養(yǎng)68h后Teff的增殖和凋亡，分析膿毒癥時Treg的功能變化，及其對Teff增殖和凋亡的影響;2.培養(yǎng)液中加入抗TGF-β抗體，應用CCK-8和Annexin V-PE法檢測共培養(yǎng)68h后Teff的增殖和凋亡，并采用Western blot法檢測

4、共培養(yǎng)后Teff細胞內Smad2/P-Smad2及Smad3/P-Smad3的蛋白水平，分析TGF-β1在膿毒癥時Treg誘導Teff凋亡中的作用;3.細胞經(jīng)DIOC6(3)染色后，流式細胞術檢測共培養(yǎng)后Teff線粒體膜電位的變化，然后采用Western blot技術檢測Teff細胞內凋亡相關蛋白Bcl-2與Bim的變化，并用化學比色法分析caspase-3，8，9的相對活性。分析膿毒癥時Treg通過膜表面TGF-β1促進Teff凋亡的

5、機制。
　　 結果:
　　 1.膿毒癥時Treg表型的變化及對Teff增殖和凋亡的影響:(1)建立了穩(wěn)定的CLP模型，術后Sham組（假傷組）小鼠無死亡，72h存活率為100％。CLP組術后72h存活率為50％，且均具有膿毒癥的表現(xiàn)。(2)與sham組相比，CLP-24h組、CLP-48h組Treg表面的TGF-β1、CTLA-4及胞內的Foxp3表達均明顯增強。(3)與兩CLP組Treg共培養(yǎng)使得Teff的增殖率與凋亡

6、率明顯升高。
　　 2.TGF-β1是膿毒癥中Treg促進Teff凋亡機制的重要信號分子:(1)與sham組相比，CLP-24h組、CLP-48h組Treg細胞內TGF-β1基因水平均升高。(2)在Treg∶Teff共培養(yǎng)體系中加入抗TGF-β抗體(25μg/ml)后，使得Teff的增殖抑制率與凋亡率均降低。(3)相對于sham組Treg，與CLP-24h組、CLP-48h組Treg共培養(yǎng)使得培養(yǎng)上清中促炎因子(IL-2、IFN

7、-γ)分泌降低，而抑炎因子(TGF-β1、IL-4、IL-10)升高。(4) Smad2、Smad3蛋白表達量在各組之間未見統(tǒng)計學差異;相對于sham組，與CLP-24h組、CLP-48h組Treg共培養(yǎng)促進Teff內P-Smad2、P-Smad3蛋白表達量增加;與未加抗TGF-β抗體比較，加入抗體之后P-Smad2、P-Smad3蛋白表達量降低。
　　 3.共培養(yǎng)后Teff細胞線粒體膜電位、Bcl-2及Bim蛋白表達量、cas

8、pase-3，8，9的相對活性的變化:(1)相對于sham組Treg，與CLP-24h組、CLP-48h組Treg共培養(yǎng)使得Teff線粒體膜電位均降低，Bcl-2蛋白表達量下降、Bim蛋白表達量升高，caspase-3，8，9的相對活性均升高。(2)與相應組別未加TGF-β抗體的培養(yǎng)條件相比，Teff∶Treg共培養(yǎng)體系中加入TGF-β抗體之后，使得Teff的線粒體膜電位升高，Bcl-2蛋白表達量升高、Bim蛋白表達量降低，caspas