細菌群體感應抑制因子的篩選與活性研究.pdf

1、隨著人類抗生素濫用,耐藥病原菌數量日益增長,傳統抗生素治療感染性疾病已難達到預期效果。因此,尋求一種新型抗生素藥物或抗菌策略來對抗耐藥菌株引起的感染疾病至關重要。細菌群體感應(Quorum sensing,QS)是細菌通過自發(fā)產生、釋放一些特定的信號分子,感知其濃度變化,激活大量基因的表達從而調節(jié)微生物生物熒光、毒力因子、生物被膜和孢子形成等生物功能的過程。細菌QS并不是影響細菌生長的重要過程,因此以細菌QS為靶標,通過阻礙信號分子與受

2、體在體內的有效結合來誘導病原菌衰竭成為研發(fā)抗菌藥物的新策略。
　　本文主要目的是利用細菌QS篩選模型從海洋微生物次級代謝產物以及中藥粗提物中篩選新型群體感應抑制劑(Quorum sensing inhibitors,QSI),并確定其結構,評價其生物活性。
　　從海南三亞沿岸采集海藻、海水和海泥,從中分離得到海洋真菌、放線菌和酵母菌共170余株,利用細菌 QS模型菌株銅綠假單胞菌( Pseudomonas aeruginos

3、a)QSIS-lasI、PQSI-pqsA和紫色桿菌(Chromobacterium violaceum) CV026對發(fā)酵粗提物進行活性篩選。其中真菌SY004、SY012和SY029具有較好的抗細菌QS活性,選擇其中對P. aeruginosa和C. violaceum均有活性的SY029進一步研究。通過18S rDNA序列比對進行菌種鑒定,該菌株應屬Aspergillus,命名為 Aspergillus sp. SY029,同時采

4、用硅膠柱色譜( silica gel column chromatographic)、 LH-20凝膠柱色譜( Sephadex LH-20 gel column chromatography)和高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等技術結合活性追蹤檢測分離純化活性化合物,核磁質譜分析確定其結構為丁內酯-I(butyrolactone-I)?；钚詸z測結果表明該化合物在不抑

5、制細菌生長的濃度范圍內,能明顯地降低P. aeruginosa毒力因子作用,如彈性蛋白酶活性和綠膿菌素產量等。為了排除P. aeruginosa自身環(huán)境以及細胞內其他QS系統作用干擾,利用大腸桿菌(Escherichia coli)異源QS報告菌株MG4/pKDT17和 pEAL08-2檢測丁內酯-I對于las和PQS群體感應系統影響,結果表明丁內酯-I能夠特異性地抑制las與PQS群體感應系統。丁內酯-I對于C. violaceum群

6、體感應調控相關的紫色菌素產量也具有明顯的抑制作用。
　　傳統中藥在現代醫(yī)藥中廣泛應用于治療人類多種疾病。近年來,科學家在中藥材中發(fā)現多種QSI,可見中藥材也是篩選QSI的重要寶庫。通過篩選近70種中藥粗提物,發(fā)現牡丹皮和秦皮具有較好的抗細菌 QS活性。利用生物自顯影(bioautography)、薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)和HPLC技術首次證明牡丹皮中 QSI為丹皮酚,秦皮中 QSI為秦

7、皮素。丹皮酚在亞抑菌濃度下能夠明顯降低C. violaceum紫色菌素產量和生物被膜形成,同時抑制了QS相關基因mRNA水平的表達。秦皮素對于P. aeruginosa PAOI毒力因子,包括彈性蛋白酶活力、綠膿菌素產量以及 swarming運動都具有一定的抑制作用,同時能夠明顯降低C. violaceum紫色菌素的生成。
　　本實驗對于新型 Q SI的篩選來源主要為海洋微生物次級代謝產物和傳統中藥材。海洋微生物具有物種以及遺傳多