豬鏈球菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌及其部分血清型多重PCR方法的建立.pdf

1、豬鏈球菌（Streptcococcus suis，SS）、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus Pleuropneumoniae，APP）和副豬嗜血桿菌（Haemophilus Parasuis，HPS）分別是引起豬鏈球菌?。⊿wine strepococosis），豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae，PCP）和格拉瑟氏病（Gl?sser’s disease）的主要病原，也

2、是養(yǎng)豬業(yè)常見的三種細菌性病原菌。這三種病原菌均有多個血清型，主要侵害幼齡仔豬和保育豬，引起一系列呼吸道癥狀，導致較高的發(fā)病率和死亡率，且在臨床上鑒別難度較大，給全球生豬養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　本研究基于豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶（gdh）基因，胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素（Apx IV）基因，副豬嗜血桿菌16S r RNA基因序列建立了豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌三重PCR方法；基于豬鏈球菌cps1J、cps2J、cps

3、7H、cps9H基因序列建立豬鏈球菌血清1、2、7、9型多重PCR方法；基于豬胸膜肺炎放線桿菌血清cps1B、cps9D、cps5B、cps2D型和Apx IV毒素基因序列建立豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清1、3、5、7型及ApxIV多重PCR方法；基于豬胸膜肺炎放線桿菌Hypb、cps6D、cps8A、cps1A基因序列建立豬傳染性胸膜肺炎血清2、6、8、12型多重PCR方法，研究結果表明，本研究建立的四套多重PCR的重復性，特異性和敏

4、感性較好，通過本方法對一些臨床樣品進行了檢測，其結果與單一PCR檢測結果一致。
　　SS、APP和HPS三重PCR方法的建立：本研究針對豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶（gdh）基因，豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素（Apx IV）基因，副豬嗜血桿菌16S r RNA基因序列各設計1對特異性引物，分別能擴增出gdh688bp、Apx IV417bp和16S rRNA822bp的DNA片段，將三對引物置于25μL體系進行優(yōu)化，找出最優(yōu)反應體系，并經(jīng)酶

5、切鑒定，確定目的片段得到了正確擴增。重復性特異性實驗表明：該實驗具有很好的重復性，對多殺性巴氏桿菌、豬大腸桿菌、豬放線桿菌、豬葡萄球菌、豬丹毒桿菌、豬沙門氏菌等具有特異性。敏感性實驗表明：最低可檢測到的細菌含量為：SS104CFU/mL；APP103CFU/mL；HPS103CFU/mL。人工模擬實驗對SS、APP、HPS的敏感性均為104CFU/mL。對采集的30份疑似病例細菌分離細菌分離鑒定后，用本研究建立的三重PCR及細菌分離方法

6、進行檢查，結果表明，該三重PCR方法靈敏度與常規(guī)細菌分離方法符合率達到93％。證明本實驗建立的SS、APP和HPS的三重PCR方法在檢測上述三種疾病方面具有應用價值。
　　SS血清1、2、7、9型多重PCR方法的建立：針對SS血清1、2、7、9型的莢膜多糖合成相關基因（CPS）序列各設計1對特異性引物，分別能擴增出550bp、675bp、150bp和300bp的DNA片段，將四對引物置于25μL體系進行優(yōu)化，找出最優(yōu)反應體系，并經(jīng)

7、酶切鑒定，確定目的片段得到了正確擴增。重復性，特異性實驗表明：該實驗具有良好的重復性，對豬丹毒桿菌、豬大腸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、葡萄球菌、豬放線桿菌、豬沙門氏菌DNA模板PCR擴增，均無特異性條帶。對豬鏈球菌野毒株提取DNA模板，分別使用本多重PCR方法和細菌分離方法檢測，將檢測結果做比較，結果顯示符合率達100%。本四重PCR方法快速有效，可在3小時左右得到檢測結果。
　　APP血清1、3、5、

8、7型及Apx IV多重PCR方法的建立：針對APP血清1、3、5、7型的cps基因及APP種屬Apx IV基因序列各設計1對特異性引物，分別能擴增出959bp、520bp、825bp、600bp和417bp的DNA片段，將五對引物置于25μL體系進行優(yōu)化，找出最優(yōu)反應體系，并經(jīng)酶切鑒定，確定目的片段得到了正確擴增。重復性，特異性實驗表明：該實驗具有良好的重復性，建立的五重PCR方法能對同一樣品中的APP血清1、3、5、7型及APP的DN

9、A模板進行擴增，均無交叉反應。對豬大腸桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬丹毒桿菌、豬沙門氏菌DNA模板PCR擴增，均無特異性條帶。對APP血清1-15型DNA模板PCR擴增，所有血清型均可擴增出Apx IV的特異性條帶，且除APP血清1、3、5、7型可以擴增出相應的特異性條帶，其他血清均只能擴增出Apx IV的特異性條帶。對APP血清1、3、5、7型及Apx IV的檢測敏感性皆為103CFU/mL。本五重PCR方法快速有

10、效，可在3小時左右得到檢測結果。
　　APP血清2、6、8、12型多重PCR方法的建立：針對APP血清2、6、8、12型的莢膜多糖合成相關基因(CPS)序列各合成1對特異性引物，分別能擴增出247bp、718bp、1106bp和347bp的DNA片段，將四對引物置于25μL的體系通過單一PCR和四重PCR體系條件的優(yōu)化，找出最優(yōu)反應體系，并經(jīng)酶切鑒定，確定目的片段得到了正確擴增。重復性，特異性實驗表明：該實驗具有良好的重復性，建立

11、的四重PCR方法能對同一樣品中的APP血清2、6、8、12型的DNA模板進行擴增，均無交叉反應。豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、豬大腸桿菌、DNA模板PCR擴增，均無特異性條帶。對APP血清1-15型基因組DNA模板PCR擴增，除APP血清2、6、8、12型可以擴增出相應的特異性條帶外均不能擴增出任何特異性條帶。對APP血清2、6、8、12型的檢測敏感性皆為103CFU/mL。人工模擬實驗對SS、APP、HPS的敏感性均為10