MUC1抗原模擬表位的篩選及鑒定.pdf

1、MUC1蛋白是一種高分子量糖蛋白,在人膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腺上皮細胞均有表達.MUC1可作為免疫治療的靶點是基于以下特點:(1)腫瘤細胞表達量增高,為正常的100倍以上;(2)腫瘤細胞MUC1廣泛分布,而正常細胞MUC1呈極性分布;(3)糖鏈的糖基化不全,導致正常情況下隱蔽的肽鏈表位暴露.MUC1的免疫原性區(qū)域主要位于該蛋白分子胞外段的20個氨基酸重復序列區(qū)域(VNTR).MUC1能引起T細胞免疫應答 ,通過T細胞受體直接識

2、別,不受主要組織相容性復合體限制.MUC1還能引起B(yǎng)細胞免疫應答產(chǎn)生抗體.目前已有多種基于MUC1的免疫原作為疫苗用于腫瘤治療的研究 ,有些已經(jīng)進入臨床試驗階段.為分析研究MUC1蛋白的結構和功能關系,了解其表面特性,本課題首先在方法學比較的基礎上,聯(lián)合運用多種方法對MUC1蛋白的二級結構和表面特性,如理化性質、親水性、免疫原性等方面進行分析和預測.結果發(fā)現(xiàn): MUC1存在有多個潛在的抗原表位位點; 位于胞外段的抗原表位位點見于VNTR

3、s(含PDTR) 140aa-156aa, 159aa-174aa,179aa-196aa.選擇針對該核心抗原表位的單抗,用于篩選隨機肽庫,有可能獲得其抗體識別的模擬表位.采用離子交換柱層析從腹水中純化了針對MUC1蛋白的鼠源性BC2抗體,洗脫液第3峰(命名為BC2 D3)含有純度較高的BC2抗體(22KD、52KD),經(jīng)Kodak成像系統(tǒng)進行掃描,所得BC2蛋白純度約為90﹪,可用于MUC1抗原模擬表位的篩選.運用噬菌體隨機7肽庫技術

4、,以純化的BC2抗體為靶蛋白,進行噬菌體隨機肽庫 3 輪篩選,根據(jù)插入?yún)^(qū)的核酸序列推導出外源多肽的氨基酸序列,獲得了MUC1抗原模擬表位TAPDLRP(x19),SAPDLRP(x9),AAPDSRP(x1)及 LAPDFRP (x1).比較所獲得的多肽氨基酸序列,依據(jù)其氨基酸序列同源程度,獲得其同源性基序:XAPDXRP.鑒定結果表明:4個噬菌體展示肽克隆抑制率均在50﹪以上,能較大程度地特異性抑制抗原抗體結合,提示這些陽性克隆的外源

5、肽具有一定的MUC1抗原模擬功能.為證實模擬抗原的免疫原性,進一步用展示MUC1抗原模擬表位的噬菌體陽性克隆免疫小鼠,3次免疫小鼠后,血清(1:1000)中能檢測到較強的MUC1抗體陽性;以最大OD450值之純化血清做為一抗行蛋白印跡分析,結果顯示:純化血清可識別MUC1蛋白;小鼠脾臟淋巴細胞增殖率檢測結果表明:噬菌體展示肽表位可在無佐劑存在情況下,大大促進小鼠的脾淋巴細胞的增殖,證明噬菌體是一較好的生物載體.結果表明該模擬抗原免疫小鼠