卵巢癌鉑類化療耐藥相關(guān)蛋白annexin A3外分泌方式及其作用機制探討.pdf

1、研究背景:
　　 卵巢癌是婦科惡性腫瘤中首位致死性疾病。在理想的腫瘤細胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上輔助鉑類藥物為主的聯(lián)合化療是臨床規(guī)范的治療手段。然而順鉑和卡鉑作為最常用的一線化療藥物,其原發(fā)或繼發(fā)耐藥性的產(chǎn)生是卵巢癌治療的主要障礙,也是晚期(Ⅲ或Ⅳ期)卵巢癌患者五年生存率較低(20～30％)的主要原因之一。目前對于鉑類化療藥物抗腫瘤作用機制的研究已經(jīng)較為深入,但對其耐藥性產(chǎn)生機制的認識相對處于初級階段,進一步預(yù)測鉑類化療耐藥的工作則更是剛

2、剛起步。早期對于鉑類化療藥物耐藥研究集中于調(diào)節(jié)耐藥的基因及分子機制。近年來則更多的關(guān)注于鉑類耐藥的細胞外基質(zhì)及新耐藥相關(guān)蛋白的探索。
　　 本課題組自2003年起開展對卵巢上皮癌鉑類化療耐藥相關(guān)蛋白的研究。運用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),篩選出5種鉑類化療耐藥相關(guān)蛋白(Annexin A3、Destrin、IDHc、GSTO1-1和Cofilin1),其中annexin A3因其在全部卵巢癌鉑類耐藥細胞中獲得共表達,顯著上調(diào),成為本課題

3、組進行鉑類耐藥研究的目標蛋白。經(jīng)免疫組織化學(xué)驗證,annexin A3在臨床卵巢癌鉑類耐藥患者的腫瘤組織中表達明顯升高,annexin A3高表達組的無瘤生存期顯著縮短。動物試驗表明,annexin A3高表達細胞,在順鉑作用后裸鼠成瘤率明顯上升。進一步運用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)annexin A3的表達后,發(fā)現(xiàn)annexin A3能夠降低細胞內(nèi)鉑含量及鉑-DNA結(jié)合量。annexin A3高表達的細胞對鉑類化療藥物的耐藥性顯著增強,但是對

4、紫杉醇、表阿霉素等藥物無交叉耐藥性,提示annexin A3可能是鉑類特異性耐藥相關(guān)蛋白。此外,annexin A3降低卵巢癌細胞P53水平。
　　 基于以上研究結(jié)果,本實驗旨在探討annexin A3成為臨床卵巢癌鉑類化療耐藥標記蛋白的可能性。在獲得annexin A3穩(wěn)定高表達或低表達的卵巢癌細胞系基礎(chǔ)上,運用Western blot技術(shù),檢測卵巢癌細胞培養(yǎng)上清中annexin A3的表達。采用ELISA分析法檢測annex

5、in A3在臨床卵巢癌患者血清中的表達,分析annexin A3外泌水平與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。通過透射電鏡及免疫電鏡觀察annexin A3表達上調(diào)及外分泌的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。進一步探討annexin A3外泌的作用及其誘導(dǎo)細胞對鉑耐藥的生物學(xué)機制。
　　 研究方法:
　　 1、運用正義annexin A3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染順鉑敏感卵巢癌細胞,獲得annexin A3穩(wěn)定表達上調(diào)的細胞克隆；同時運用反義annexin A3質(zhì)粒下調(diào)順

6、鉑耐藥卵巢癌細胞內(nèi)annexin A3水平,獲得annexin A3穩(wěn)定表達下調(diào)的細胞克隆。采用免疫熒光激光共聚交技術(shù)檢測annexin A3表達水平的變化,以及在細胞內(nèi)的定位。收集細胞培養(yǎng)基上清,采用免疫印跡技術(shù)檢測培養(yǎng)基上清中annexin A3的表達,同時比較其外泌水平與細胞內(nèi)annexin A3表達水平、細胞耐藥性的關(guān)系。收集臨床卵巢癌患者手術(shù)前血清50例,以ELISA法檢測annexin A3在人外周血中的表達水平。
　

7、　 2、采用Signal—P等軟件分析annexin A3的分子結(jié)構(gòu)。透射電鏡觀察卵巢癌鉑類耐藥細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的特征,以及運用siRNA瞬時下調(diào)順鉑耐藥卵巢癌細胞內(nèi)annexin A3表達水平后對于細胞形態(tài)的影響。以膠體金標記annexin A3蛋白,運用免疫電鏡觀察annexin A3在亞細胞器中的定位。進一步收集annexin A3高表達的細胞培養(yǎng)基上清,分別采用小量提取法和梯度離心法收集細胞培養(yǎng)基上清中的exosome,選擇適合

8、本實驗的exosome收集方法。根據(jù)exosome所含蛋白質(zhì)濃度對各卵巢癌細胞系分泌的exosome進行定量,觀察annexin A3對exosome分泌數(shù)量的影響。
　　 3、利用電感耦合等離子質(zhì)譜法分別檢測細胞內(nèi)、細胞培養(yǎng)上清中、以及exosome內(nèi)的鉑含量。以CDDP至終濃度10μM分別作用卵巢癌鉑類敏感、耐藥、分別轉(zhuǎn)染正反義質(zhì)粒、以及siRNA下調(diào)annexin A3表達的細胞,于不同時間點收集細胞,觀察annexin

9、A3對卵巢癌細胞鉑吸收的影響。以CDDP至終濃度10μM分別作用上述細胞36小時,更換無藥無血清培養(yǎng)基,于不同時間點收集細胞,觀察annexin A3對卵巢癌細胞鉑外流的影響。以CDDP至終濃度10μM分別作用上述細胞24小時,更換無藥無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時。梯度離心法收集細胞培養(yǎng)基上清中的exosome,分析其中的鉑含量。
　　 4、收集臨床卵巢癌患者手術(shù)前血清50例,術(shù)后正規(guī)隨診至少1年。將所有卵巢癌患者分為鉑類化療耐

10、藥組和敏感組,同期收集本院體檢中心正常婦女血清30例作為對照。運用ELISA法檢測卵巢癌患者及正常婦女血清中的annexin A3表達水平,探討外分泌蛋白annexin A3預(yù)測卵巢癌耐藥的敏感性和特異性。同時運用生存分析方法繪制Kaplan-Meier曲線,分析血清中annexin A3蛋白表達水平與卵巢癌患者無瘤生存期的關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1、Annexin A3蛋白主要在卵巢癌細胞的胞漿內(nèi)表達,在胞核內(nèi)無顯

11、著表現(xiàn),在胞膜無表達。在卵巢上皮癌細胞系的培養(yǎng)基上清中檢測出annexinA3蛋白表達,其強度與細胞內(nèi)annexin A3的表達水平呈正相關(guān)關(guān)系。進一步的體內(nèi)實驗在臨床卵巢癌患者的外周血中檢測出annexin A3蛋白的表達,充分證實annexin A3是一個可分泌蛋白。
　　 2、Annexin A3蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中不具備典型信號肽結(jié)構(gòu),不能經(jīng)過經(jīng)典的信號肽途徑分泌。經(jīng)過透射電鏡和免疫電鏡的分析,annexin A3蛋白在卵巢

12、癌耐藥細胞內(nèi)的表達明顯上調(diào)后,觀察到在細胞漿內(nèi)大量囊泡樣結(jié)構(gòu)的形成,囊泡樣小體與細胞膜的融合及分離,進而在細胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)表達annexin A3蛋白的exosome小體,exosome的定量與胞漿內(nèi)annexin A3的表達水平呈正相關(guān)。上述研究結(jié)果揭示出annexin A3出胞完整的生物學(xué)過程,即細胞漿內(nèi)annexin A3的表達上調(diào)致使大量囊泡樣結(jié)構(gòu)的聚集,形成囊泡樣小體,小體與細胞膜融合脫離,繼而以exosome的形式完成an

13、nexin A3蛋白的外分泌。
　　 3、Annexin A3蛋白外泌與調(diào)節(jié)卵巢癌細胞對于鉑類耐藥的相關(guān)性。本實驗證明,Annexin A3蛋白的表達上調(diào)對于卵巢癌細胞對鉑的吸收過程沒有明顯的影響,但細胞對于鉑的釋放顯著增加。對exosome內(nèi)鉑濃度的測定結(jié)果表明,annexin A3蛋白外分泌過程將鉑離子帶出細胞外,從而使鉑類藥物不能與卵巢癌細胞的DNA相結(jié)合,產(chǎn)生耐藥性。
　　 4、小樣本的臨床研究表明,正常婦女組血