L-arginine對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老的作用及機制研究.pdf

1、現(xiàn)今,糖尿病已成為嚴重危害人類健康的全球流行性疾病,其血管并發(fā)癥是患者致殘、致死的主要因為。與非糖尿病人群相比,糖尿病人群中動脈粥樣硬化性疾病的患病率高、發(fā)病年齡輕、病情進展較快,多臟器同時受累較多。一些研究指出,高血糖可以加速細胞的衰老,而內(nèi)皮細胞衰老是動脈粥樣硬化的早期病理改變,因此,研究高糖致內(nèi)皮細胞衰老的機制,從而發(fā)展有效阻斷藥物,是防治糖尿病大血管病變的有效途徑。
　　 內(nèi)皮細胞是糖尿病血管病變的關(guān)鍵靶組織。它不僅在抗

2、凝血因子形成過程中起著保護屏障作用,而且其自身可分泌因子調(diào)節(jié)血管管腔和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。正常生理狀態(tài)下,內(nèi)皮細胞的更新率很低,分裂增殖能力有限,但因損傷(如高糖刺激)導(dǎo)致細胞不斷的分裂將引起端?？s短,細胞進入衰老期,表現(xiàn)為SA-βgal活性增強、細胞停滯在細胞周期的G0/G1期、衰老相關(guān)的基因和蛋白表達陽性以及端粒酶活性降低等；同時,血管內(nèi)皮細胞衰老過程中,分泌的各種生物學(xué)活性因子也在發(fā)生變化,如NO的合成下降、炎性因子合成增加、粘

3、附因子表達增多等。這些變化都將造成內(nèi)皮細胞功能障礙,最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生?？梢?衰老與糖尿病相關(guān)的動脈粥樣硬化存在密切關(guān)系。
　　 端粒鐘學(xué)說是衰老發(fā)生機制的學(xué)說之一。端粒是真核細胞染色體末端的DNA序列,隨著細胞的每次分裂,端粒不斷縮短,當(dāng)縮短到一個閾值時,便不能維持染色體的穩(wěn)定,使細胞失去分裂增殖能力而進入了衰老階段。因此,端?？s短被認為是觸發(fā)細胞衰老的分子鐘,可作為衰老的生物標記。端粒酶是一種核糖核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶,可以

4、在縮短的端粒末端加上新的重復(fù)序列,保持端粒長度,在調(diào)節(jié)壽命與細胞增殖方面扮演著重要的角色。端粒酶活性的調(diào)控是多因素的,PI3K/Akt通路正是其中之一。對黑色素細胞瘤細胞系SK-MEL-28的研究發(fā)現(xiàn),在無血清培養(yǎng)24小時后腫瘤細胞Akt活性升高,端粒酶的活性增加2倍,而端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(Human Telomerase Reverse Transcriptase Subunit,hTERT)的兩個XXRXRXXSXX序列也相應(yīng)出

5、現(xiàn)了磷酸化；應(yīng)用PI3K抑制劑可以降低腫瘤細胞端粒酶的活性并抑制hTERT的磷酸化。因此,Akt必然成為端粒酶十分重要的上游調(diào)節(jié)點。
　　 氧化應(yīng)激的增加與NO生物利用度的減少在細胞衰老中起著重要的作用。有研究顯示高糖可以增加細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,而后者可通過抑制Src家族激酶的活性而縮短端粒的長度,加快衰老的進程。NO能與過量的ROS反應(yīng)而減輕細胞氧化應(yīng)激的程度。NO被認為是最主要的內(nèi)皮源性自分泌因子,它可以調(diào)節(jié)血管管腔大小,抑

6、制血小板聚集、抗凋亡、抑制平滑肌細胞增殖和白細胞粘附,因而在抗動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮著重要的作用。很多研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮型NOS(eNOS)的表達和NO的合成隨年齡的增加而下降,雖然其機制目前還不明確,但有研究表明PI3K/Akt可以介導(dǎo)eNOS的磷酸化,亦有研究顯示2型糖尿病患者內(nèi)皮功能紊亂與PI3K/Akt/eNOS通路受到抑制有關(guān)。因此,在內(nèi)皮細胞中上調(diào)PI3K/Akt信號系統(tǒng)應(yīng)是防治糖尿病大血管病變的一個重要靶點。
　　 L-

7、Arg是NO合成的前體物質(zhì),在1992年Creager和Dubois-Rarde兩組學(xué)者首次斷定,補充eNOS作用的底物L(fēng)-Arg是增加內(nèi)皮產(chǎn)生生物活性NO的一種方法。L-Arg改善內(nèi)皮細胞功能的機制相對多樣化,尚未闡明,這種作用可能與增力INO的合成和eNOS蛋白表達,減少ROS的形成有關(guān)。
　　 綜上所述,本實驗在體外模擬高糖狀態(tài),觀察高血糖是否加速人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老,其對NO、eNOS蛋白表達及轉(zhuǎn)錄水平的影響,以及與PI

8、3K/Akt信號通路的關(guān)系,而L-Arg是否可以延緩高糖加速的內(nèi)皮細胞衰老的進程,其作用機制是否與PI3K/Akt通路有關(guān),為進一步探討糖尿病大血管病變發(fā)病機制及其防治手段提供實驗依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、人臍靜脈內(nèi)皮細胞株培養(yǎng),不同濃度的葡萄糖溶液孵育細胞、高糖(33 mM)和/或不同濃度L-arginine共同孵育細胞,以及同一濃度孵育不同的時間,收集內(nèi)皮細胞及細胞培養(yǎng)液；分別用PI3K/Akt特異性抑制

9、劑LY294002、eNOS特異性抑制劑L-NAME進行預(yù)處理2 h,然后于上述因素孵育細胞,收集內(nèi)皮細胞及細胞培養(yǎng)液,用于指標檢測。
　　 2、衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性檢測是通過染色計算陽性細胞的百分比來確定,后者是指1000個細胞中被染成藍綠色細胞的百分比。
　　 3、采用PCR-ELISA法檢測端粒酶的活性。
　　 4、應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測活性氧及分析細胞周期。
　　 5、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測

10、PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達。
　　 6、采用Westemblot法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞p-Akt(Ser-473)、Akt、p-eNOS(Ser-1177)、eNOS蛋白的表達。
　　 7、采用硝酸鹽還原酶還原硝酸鹽為亞硝酸鹽,然后通過經(jīng)典的Griess reagent檢測亞硝酸鹽,從而測定出總一氧化氮。
　　 結(jié)果：
　　 1、隨著糖濃度的增加(即5.5、11、22、33 mmol/L)

11、SA β-gal活性逐漸增強(P<0.01),端粒酶活性逐漸減弱(P<0.01),G0/G1期細胞不斷增加(P<0.01),S期細胞不斷減少(P<0.01)。
　　 2、隨著糖濃度的不斷增加,細胞內(nèi)ROS逐漸增多(P<0.01),而NO的產(chǎn)量逐漸減少(P<0.001)。
　　 3、與正常對照組相比,33mmol/L糖濃度組72 h PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達明顯下降(P<0.05)。
　　 4、與

12、正常對照組相比,33mmol/L糖濃度組48 h p-Akt(Ser-473)/Akt、p-eNOS(Ser-1177)/eNOS蛋白表達量的比值明顯減弱(P<0.01)。
　　 5、應(yīng)用不同濃度L-arginine(0.4、0.8、1.6mmol/L)與高糖(33 mmol/L)共同干預(yù)細胞,不同程度地減弱了SA β-gal活性(與高糖組比較,P<0.01),增強了端粒酶的活性(P<0.01),G0/G1期細胞較高糖組明顯減少

13、(P<0.01),S期細胞明顯增多(P<0.01)。而3.2mmol/L的L-arginine出現(xiàn)相反作用,各指標與高糖組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 6、與高糖組比較,L-arginine(0.4、0.8、1.6mmol/L)明顯減少細胞內(nèi)的ROS水平(P<0.001),明顯增多NO的合成(P<0.001)。
　　 7、與高糖組比較,L-arginine(0.8 mmol/L)作用內(nèi)皮細胞72 h使PI3K、Akt、eNO

14、SmRNA的表達明顯增強(P<0.01)。
　　 8、與高糖組比較,L-arginine(0.4、0.8、1.6mmol/L)明顯增加了p-Akt(Ser-473)/Akt、p-eNOS(Ser-1177)/eNOS蛋白的表達量的比值(P<0.01)。
　　 9、PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002及eNOS特異性抑制劑L-NAME可以抑制L-arginine的抗衰老作用。
　　 結(jié)論：
　　 1