胃癌組織中E-cadherin和S100A2表達與其臨床生物學行為關系的研究.pdf

1、胃癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率最高的癌癥之一,但其發(fā)病機制不清,目前尚不能有效地預防其發(fā)生及治療。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學特征,腫瘤轉(zhuǎn)移的研究始終是一個令人關注的重要課題。腫瘤轉(zhuǎn)移涉及許多基因的改變,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關的基因有MMP,NM23、TIMP1、TIMP2,WDNM、H2-K、INOS、KISS1,CAV1、S100A4、MTA1、KIT和MCAM等。細胞黏附分子E-cadherin蛋白是維持上皮細胞極性及細胞間

2、連接的糖蛋白,其結(jié)構(gòu)和功能的異常可導致細胞間黏附能力減弱,在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。S100A2是S100基因家族中的一員,是該蛋白家族中唯一與腫瘤生長呈負相關的蛋白質(zhì)分子。S100A2基因作為候選抑癌基因,在許多惡性腫瘤中表達明顯降低,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。Tsai等研究發(fā)現(xiàn)S100A2的表達能減弱腫瘤細胞的運動性和侵襲能力,與腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤密切相關。
　　 表觀遺傳(epigenetic)的變化是

3、真核基因組一種獨特的調(diào)控機制,主要通過DNA(DNA methylation)甲基化、RNA沉默和組蛋白修飾等方式來控制基因的沉默。DNA甲基化是基因組內(nèi)一種重要的堿基修飾現(xiàn)象,是重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一,在胚胎發(fā)育、遺傳印記和x染色體失活中發(fā)揮著重要的作用。最近10多年來,通過對DNA甲基化模式的研究,人們發(fā)現(xiàn)許多種類的癌細胞都有著異常的DNA甲基化行為,表現(xiàn)為基因組范圍的低甲基化和特異位點的高甲基化?；蚪M范圍的低甲基化可通過影響

4、染色體的穩(wěn)定性而啟動癌的發(fā)生,實驗表明鼠單純DNA低甲基化可以誘導T淋巴細胞瘤。特異位點的高甲基化是指腫瘤抑制基因常常被過量地甲基化而導致失去活性,而被看作是抑癌基因沉默的“第二次打擊”事件。如VHL,HIC-1,Rb,P15,P16等基因在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)他們的啟動子區(qū)發(fā)生異常的甲基化。
　　 RNAi(RNA interference)技術是近年發(fā)展起來的基因沉默技術,是利用雙鏈RNA(dsRNA)特異性地降解與其同源的mRN

5、A序列,從而特異性地阻斷相應基因的表達。RNAi作為一種替代基因敲除的簡單有效的工具,在功能基因組學研究、基因治療等領域受到越來越多的重視。
　　 目的：
　　 本研究采用半定量RT-PCR方法及免疫組化方法檢測了不同進展時期的胃癌組織標本、配對癌旁組織及正常胃黏膜組織E-cadherin和S100A2的表達情況,分析它們與腫瘤臨床特征的相關性,揭示了它們在胃癌進展中的作用;進一步采用甲基化特異性PCR方法,檢測胃癌組織

6、標本E-cadherin及S100A2基因啟動子區(qū)甲基化情況,以揭示基因表達下降的機制及胃癌發(fā)病機制;采用RNAi技術,在E-cadherin和S100A2表達陽性的胃癌細胞系.MNK45細胞同時沉默E-cadherin和S100A2基因表達,觀察干涉后的細胞效應,以研究E-cadherin和S100A2的功能及在胃癌發(fā)生中的作用機制。
　　 材料及方法：
　　 1、實驗材料
　　 ①組織標本:不同進展期胃癌組織

7、標本64例,正常胃粘膜標本15例,均來自遼寧省腫瘤醫(yī)院。
　　 ②細胞株:MKN-45,來源于低分化腺癌,來自中國醫(yī)科大學細胞生物教研室
　　 ③質(zhì)粒:pNeo-RNAi-E-cadherin siRNA,pNeo-RNAi-S100A2 siRNA表達載體由美國加州大學惠贈。
　　 2、實驗方法
　　 ①半定量RT-PCR:Trizol試劑提取組織標本和細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR擴增E-ca

8、dherin和S100A2特異性片段,以β-actin為內(nèi)對照,進行半定量分析。
　　 ②免疫組化:制備組織標本石蠟切片,用E-cadherin和S100A2特異性抗體進行雜交,統(tǒng)計分析蛋白和基因表達與臨床特征間的相關性。
　　 ③甲基化特異性PCR:酚氯仿提取胃癌組織標本DNA,亞硫酸鹽修飾DNA后,純化產(chǎn)物。用甲基化特異性引物進行PCR擴增,檢測擴增結(jié)果并進行統(tǒng)計分析。
　　 ④Western Blot:檢測

9、RNA干涉后MKN-45細胞中E-cadherin和S100A2蛋白表達情況。
　　 ⑤MTT實驗:檢測RNA干涉后MKN-45細胞增殖情況。
　　 ⑥Transwell實驗:分析RNA干涉后細胞侵襲力的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、E-cadherin RT-PCR結(jié)果:正常對照胃黏膜組織E-cadherin基因表達陽性率為100％,不同進展期的胃癌組織基因表達的陽性率下降。E-cadherin在

10、64例胃癌的表達量為1.245±0.153,而正常胃組織的E-cadherin表達量為2.105±0.216,差異有顯著(P＜0.01)。
　　 2、S100A2 RT-PCR結(jié)果:正常對照胃黏膜組織基因表達陽性率為100％,不同進展期胃癌組織基因表達的陽性率下降。S100A2在64例胃癌的表達量為1.877±0.224,而正常胃組織的S100A2表達量為2.387±0.293,差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 3、

11、E-cadherin免疫組化結(jié)果:E-cadherin主要表達在細胞膜,細胞漿中有少量表達。結(jié)果顯示正常胃黏膜組織蛋白表達陽性率為100％,64例胃癌組織中蛋白表達陽性率下降為71.87％(46/64)。
　　 4、S100A2免疫組化結(jié)果:陽性表達見于腺上皮細胞的胞漿和胞核。15例正常胃黏膜組織蛋白表達陽性率為100％,胃癌組織中蛋白表達陽性率為62.5％(40/64),明顯低于正常胃黏膜組織。
　　 5、E-cadh

12、erin的表達與胃癌臨床病理特征的關系:E-cadherin在不同分化程度,不同浸潤深度的胃癌中表達差異有顯著性(P＜0.05);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組中,E-cadherin的表達量差異有顯著性(P＜0.01),而在不同生長方式上表達差異無統(tǒng)計學意義。而E-cadherin蛋白在各種臨床特征分組上表達差異均具有顯著性(p＜0.01)
　　 6、S100A2的表達與胃癌臨床病理特征的關系:S100A2在不同分化程度

13、,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例組中胃癌中表達差異有顯著性(P＜0.01);在不同浸潤深度的胃癌組織中表達差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05),而S100A2的表達量在不同生長方式上差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而S100A2的表達在各臨床特征分組上表達差異均具有顯著(p＜0.01,P＜0.05)
　　 7、E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化特異性PCR擴增結(jié)果:64例胃癌組織標本甲基化比率為59.38％(38/64),

14、正常胃粘膜組織甲基化比率為13.3％(2/15).
　　 8、S100A2基因啟動子區(qū)甲基化特異性PCR擴增結(jié)果:64例胃癌組織標本甲基化比率為56.25％(36/64),正常胃粘膜組織甲基化比率為13.3％(2/15)。
　　 9、胃癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌生物行為的關系:E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化在高、中分化組,低、未分化胃癌組織中差異顯著(p＜0.01)。淋巴轉(zhuǎn)移陽性組、浸潤

15、深度漿膜外組甲基化程度高于相對應的陰性組及漿膜內(nèi)組,差異顯著(p＜0.01)。在生長方式特征上,兩組無統(tǒng)計學差異。
　　 10、胃癌組織中S100A2基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌生物行為的關系:S100A2基因啟動子區(qū)甲基化在低、未分化,高、中分化組胃癌組織中差異顯著(p＜0.05)。淋巴轉(zhuǎn)移陽性組、浸潤深度漿膜外組甲基化程度高于相對應的陰性組及漿膜內(nèi)組,差異顯著(p＜0.01,p＜0.05)。在生長方式特征上,兩組無統(tǒng)計學差異。<

16、br>　　 11、siRNA對MKN45細胞E-cadherin和S100A2 mRNA表達明顯抑制:RNAi第7天RT-PCR擴增結(jié)果與對照相比E-cadherin和S100A2 mRNA表達明顯抑制。
　　 12、siRNA對MKN45細胞E-cadherin和S100A2蛋白表達的影響:siRNA干涉第7天,實驗組與對照組相比E-cadherin和S100A2蛋白表達無明顯減弱;干涉第10天,實驗組大約90％細胞蛋白表達

17、減弱,表明E-cadherin和S100A2蛋白表達受到抑制。
　　 13、E-cadherin和S100A2蛋白表達下調(diào)對細胞增殖的影響:MTT實驗顯示E-cadherin和S100A2表達抑制后細胞生長速度增加。將pNeo-RNAi-E-cadherin和pNeo-RNAi-S100A2重組載體轉(zhuǎn)染MKN45細胞后,細胞生長率逐漸增加,第7天和10天增長率分別為12％和25％(P＜0.05)。
　　 14、E-cad

18、herin和S100A2蛋白表達下調(diào)對細胞侵襲力的影響:干涉第11天,E-cadherin和S100A2蛋白表達下調(diào),細胞侵襲力明顯增加。干涉前后都有細胞穿透濾膜,但干涉后細胞數(shù)明顯高于干涉前,細胞數(shù)分別為49±5和68±8,兩組有顯著差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、E-cadherin和S100A2在胃癌組織中表達均下降,是腫瘤抑制因子。
　　 2、E-cadherin和S100A2的表達與胃癌