定量蛋白質組學與生物信息學結合研究TLR信號通路以及MyD88的復合物.pdf

1、天然免疫系統(tǒng)是生物體抵御微生物感染的第一道防線。自從在果蠅里發(fā)現(xiàn)Toll樣受體在真菌感染下能有效地誘導免疫系統(tǒng)發(fā)生反應開始，越來越多的證據表明天然免疫系統(tǒng)能夠特異性識別病原菌的入侵。天然免疫系統(tǒng)識別的對象是一類結構保守的病原微生物，即病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)。而天然免疫系統(tǒng)中的受體則稱之為模式識別受體(pattern recognition recept

2、ors，PRRs)。PRRs對PAMPs的特異性識別有效地監(jiān)測了病原微生物的入侵并且誘導機體產生免疫應答反應。Toll樣受體就是一類非常重要的模式識別受體(PRRs)，能識別細菌，真菌，核酸，病毒等等。目前已發(fā)現(xiàn)十多種Toll樣受體，他們不僅在天然免疫系統(tǒng)中起著關鍵作用，同時也是連接天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)的橋梁。對TLR信號通路的研究對免疫學的發(fā)展來說是至關重要的，目前對TLR信號通路的研究主要是通過分子生物學在基因層面上進行的。

3、在蛋白層面上，缺乏大規(guī)模的研究數(shù)據。本論文依托基于質譜的細胞體內穩(wěn)定同位素標記定量蛋白質組學技術（AACT/SILAC）和生物信息學分析，在蛋白層面上對TLR信號通路及其關鍵接頭蛋白MyD88的復合物進行了全面系統(tǒng)的研究工作。
　　論文的第一章介紹了近年來定量蛋白質組學在方法和技術路線上的發(fā)展概況，強調了本文所用的氨基酸穩(wěn)定同位素標記技術(AACT/SILAC)。在此基礎上，進一步綜述了目前基于質譜技術的蛋白質相互作用的一些傳統(tǒng)生

4、物學研究方法以及生物信息學預測分析，并且指出各自的優(yōu)缺點。由以上這些技術背景介紹引出了本論文的研究背景;并且在最后闡述了本論文的研究目的和意義。論文的研究工作主要分三部分，第一部分主要研究的是LPS短時間刺激下巨噬細胞亞細胞組分的TLR4信號通路變化;第二部分主要是初步探索LPS以及Zymosan刺激巨噬細胞時TLRs受體的主要接頭蛋白內源性MyD88的蛋白復合物情況;第三部分主要是改進了第二部分的免疫沉淀方法并結合蛋白結構域的信息來研

5、究LPS刺激時內源性MyD88復合物的變化。下面將詳細介紹各章內容:
　　（一）亞細胞定量蛋白組學和生物信息學解析LPS短時刺激下引起的巨噬細胞內TLR4信號通路的變化
　　脂多糖LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁內毒素的主要成分，LPS作為一個主要的促炎癥因子，以污染的形式廣泛存在于空氣顆粒中包括大氣污染、有機粉塵、香煙霧等地方。作為天然免疫系統(tǒng)的第一道防線，Toll樣受體4(TLR4)能夠特異性的識別脂多糖并且激活調節(jié)一系列的信

6、號轉導以此來激活受感染宿主的免疫炎癥反應。對于TLR4通路的研究中，盡管已經有大量參與到該通路的基因和蛋白的功能得到了驗證，但是大部分研究都是通過傳統(tǒng)生物學手段以單個基因或蛋白為研究對象來進行的。目前為止對由LPS所誘導的TLR4信號通路的整個調控機制及網絡仍然缺乏大規(guī)模系統(tǒng)性的研究，可以說現(xiàn)在所得到的TLR4信號通路仍然是很不完整的，還有很多未知的東西可以探索。
　　通過之前的一些研究成果，我們發(fā)現(xiàn)大部分信號通路都在脂多糖(LP

7、S)感染宿主的初期階段就被激活。因此，我們選擇了細胞體內穩(wěn)定同位素標記的這一強大的定量蛋白質組學技術來對活體巨噬細胞受到LPS感染后，蛋白在細胞核和細胞質內的差異表達情況進行系統(tǒng)的研究。通過對細胞器的分離（細胞核與細胞質）不僅可以有效降低樣品分離的復雜性，提高了質譜對樣品的鑒定能力，并且可以發(fā)現(xiàn)某些有意義的低豐度信號蛋白在特定細胞器中得到了富集，從而使我們更好的了解宿主受感染后它們是如何發(fā)揮作用的。通過這一亞細胞定量蛋白組學的方法，在細

8、胞受到LPS刺激10分鐘后，在細胞質中鑒定到508個蛋白發(fā)生了上調，103個蛋白發(fā)生了下調;與此同時，在細胞核中鑒定到678個上調蛋白，80個下調蛋白。我們對鑒定到的兩部分蛋白進行了基本的生物信息學功能分析，發(fā)現(xiàn)在S1胞質部分，差異表達的蛋白主要參與了蛋白代謝，蛋白修飾，細胞周期，凋亡等生物學過程;而S3核部分蛋白更多的參與了RNA剪接、DNA/RNA代謝、轉錄等生物學過程，這與我們采取核與胞質和核的亞細胞分離手段的預期結果一致。

9、>　　同時，我們還發(fā)現(xiàn)許多關鍵的涉及MAPK通路和NF-κB通路的信號蛋白是在細胞質中被激活，而各類重要的轉錄因子比如干擾素調節(jié)因子(IRFs)則在細胞核中被激活。通過生物信息學的分析，我們構建了各個被激活信號通路的串聯(lián)網絡圖并將這一網絡圖延伸到了細胞凋亡的調控中。更為重要的是，借助生物信息學分析，我們第一次在蛋白層面上全面系統(tǒng)的認識到了這些上游激活的信號通路是如何相互串聯(lián)來調節(jié)激活下游的轉錄因子的。而激活的轉錄因子又調控了一系列促炎癥

10、因子的表達從而參與到多種生物學過程包括蛋白和核酸代謝，DNA損傷修復，細胞周期調控以及宿主防御等等。對TLR4通路的全面解析對相關的免疫性疾病的診斷、治療、預防等具有重要的指導意義。
　?。ǘ┙Y合傳統(tǒng)免疫共沉淀及AACT技術初步探索TLR2、TLR4信號通路中內源性MyD88的復合物
　　目前已經發(fā)現(xiàn)13個TLR家族，雖然不同的TLR所識別的PAMPs不同，但髓樣分化因子88(myeloid differentiation

11、 factor 88，MyD88)是除了TLR3以外所有TLR家族路中關鍵的接頭分子，是信號向下游轉導的關鍵靶蛋白。MyD88可以通過其死亡結構域(Death Domain，DD)募集下游信號分子使信號下傳，激活一系列的下游信號通路，這些激活的下游通路又互相關聯(lián)來控制炎癥反應。因此研究MyD88的復合物能使我們更好的了解宿主受到感染時TLRs信號通路的調控機制。
　　現(xiàn)在已經發(fā)展很多與質譜技術相結合的方法用于大規(guī)模研究蛋白相互作用

12、，比如串聯(lián)親和純化（TAP技術）以及體內雙標簽技術等，但是這些技術都會涉及到在細胞內構建標簽蛋白，這就在一定程度上改變了細胞的生理環(huán)境以及蛋白特性。而且內源性靶蛋白可能與標簽蛋白產生競爭作用。因此研究蛋白相互作用最理想的方法是用免疫共沉淀的方法直接把內源性的靶蛋白復合物pull down下來。然而傳統(tǒng)免疫沉淀的缺點在于背景高，沉淀下的復合物很可能是假陽性的。這里我們將AACT/SILAC技術與傳統(tǒng)免疫沉淀相結合，很好的彌補了免疫沉淀的這

13、個缺陷，通過質譜鑒定后的定量信息篩選出特異性相互作用的蛋白復合物。
　　這里我們使用TLR4受體的配體LPS以及TLR2受體的配體Zymosan刺激巨噬細胞，結合上述方法鑒定挑選出了82個受LPS刺激后以及56個受Zymosan刺激后與內源性MyD88相互作用增強的蛋白復合物。并通過生物信息學對它們進行了初步功能分析。表明了MyD88及其復合物在調控TLR4以及TLR2通路上的異同點。
　　（三）基于AACT的磁珠免疫共沉淀

14、和蛋白結構域信息鑒定和分析LPS刺激下RAW264.7細胞中內源性MyD88的復合物
　　傳統(tǒng)瓊脂糖免疫共沉淀的方法雖然能研究生理條件下的蛋白復合物，但是由于步驟太多，容易產生誤差，損失弱相互作用蛋白。這里我們利用商品化的磁珠protein A beads取代傳統(tǒng)瓊脂糖protein A beads，大大簡化了實驗步驟，減少了細胞用量。我們將這一改進的免疫共沉淀與AACT/SILAC技術相結合，鑒定篩選出了161個在LPS刺激后與

15、內源性MyD88相互作用增強的蛋白。
　　生物信息學在蛋白相互作用中的預測和驗證中起到了重要作用。蛋白相互作用通常不需要蛋白全長的參與，而是通過蛋白質結構域來完成的。一些數(shù)據庫通過對以往所得蛋白相互作用數(shù)據的研究而歸納總結出結構域相互作用的規(guī)律，這些規(guī)律可以被用來旁證新得到的相互作用蛋白的可信度。
　　這里我們應用蛋白結構域聚類的方法對我們所得到的數(shù)據進行分析，發(fā)現(xiàn)我們所得到的數(shù)據有結構域聚類的現(xiàn)象，含有這些結構域的蛋白會涉

16、及多個生理學過程，說明MyD88會募集不同功能的蛋白來共同協(xié)調整個TLR信號通路。我們進一步通過對蛋白結構域相互作用的分析，預測了這些蛋白復合物兩兩之間的相互作用關系，發(fā)現(xiàn)MyD88募集的復合物主要可以分為3層，最有可能和MyD88發(fā)生直接相互作用的蛋白是第一層相互作用蛋白，這類蛋白主要涉及激酶活性等功能從而很好的激活上游的信號級聯(lián)通路。通過與第一層相互作用蛋白的連接，第二層相互作用蛋白接收到這些信號，并調動了一系列蛋白來參與涉及多個生