ECSOD基因轉染MSCs移植治療缺血性腦卒中大鼠的實驗研究.pdf

1、第一部分
　　ECSOD基因表達載體的構建并轉染至骨髓間充質(zhì)干細胞的實驗研究
　　實驗目的:構建胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase，ECSOD)基因表達載體，經(jīng)慢病毒包裝后轉染至成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mar-rowmesenchymal stem cell，MSCs)，觀察和檢測ECSOD基因的轉染效率及轉染后對細胞

2、活力的影響與ECSOD蛋白表達情況。
　　實驗方法:利用基因工程技術從MSCs中提取總的RNA，經(jīng)PCR擴增、載體雙酶切后，獲得ECSOD基因片段，將其基因片段連接到GV230-EGFP載體構建GV230-EGFP-ECSOD表達載體，經(jīng)菌落PCR及測序，鑒定載體構建是否成功，采用慢病毒包裝后將GV230-EGFP-ECSOD導入MSCs中，熒光顯微鏡檢測轉染效率，實時熒光定量多聚酶鏈反應(Quantitati-ve Polyme

3、rase Chain Reaction，QPCR)對轉染后對MSCs中mRNA定量分析，MTT及EDU檢測轉染后ECSOD基因對細胞活力與增殖影響，Western Blot檢測ECSOD基因表達情況。
　　實驗結果:提取RNA產(chǎn)物經(jīng)PCR擴增、雙酶切成功將目的基因連接至真核表達載體GV230-EGFP中，菌落PCR獲得目的基因大小和陽性對照一致，菌落PCR陽性轉化子經(jīng)測序分析與目的基因序列完全一致;慢病毒包裝的GV230-EGFP

4、-ECSOD成功轉染至MSCs，培養(yǎng)48h后在熒光顯微鏡下觀察并計算得MSCs轉染率為(75±3.6)％，進一步采用QPCR定量測定轉染后mRNA含量明顯高于對照組。EDU與MTT檢測發(fā)現(xiàn)ECSOD基因轉染MSCs后對細胞活力無影響。Western Blot檢測證實ECSOD基因轉染MSCs后，MSCs中ECSOD蛋白呈陽性表達。
　　實驗結論:成功構建GV230-EGFP-ECSOD真核表達載體，通過慢病毒包裝轉染技術將ECSO

5、D基因轉染到MSCs中且表達ECSOD蛋白，進而為下一步研究ECSOD基因轉染MSCs治療腦梗塞動物模型奠定實驗基礎。
　　第二部分
　　ECSOD基因轉染SCs移植治療缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)保護作用的實驗研究
　　實驗目的:觀察ECSOD基因轉染的MSCs移植治療缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)保護作用。
　　實驗方法:將80只Sprague DaWley(SD)成年雄性大鼠，隨機分為兩組6h組(n=40)、12h組(n=

6、40)，分別將6h、12h組分為四個亞組:Model組(n=10)、PBS組(n=10)、MSCs組(n=10)、ECSOD-MSCs組(n=10);根據(jù)改良Zea Longa線栓法制作左側大腦中動脈缺血模型，分別在造模成功后6h、12h腦缺血/再灌注，同時經(jīng)顱立體定位對后三組腦缺血大鼠分別注射10μ LPBS液、MSCs液、ECSOD-MSCs液，Model組不做處理。腦缺血/再灌注后1d、3d、7d、2w、4w進行改良神經(jīng)功能評分(

7、Modified Neurological Severity Score，mNSS)評估預后，缺血/再灌注后1天、28天分別行MRI檢查測定大鼠腦梗塞體積變化情況。4周后取腦組織采用免疫組織化學方法測定腦組織梗塞周圍ECSOD、Bax、Bcl-2的表達情況。
　　實驗結果:移植后2w、4w，ECSOD-MSCs組和MSCs組的mNSS評分較PBS組、Model組低(P＜0.05)，其中ECSOD-MSCs組mNSS評分更低。移植后

8、腦梗塞體積變化的相對值比較ECSOD-MSCs組、MSCs組明顯大于PBS組、Model組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中ECSOD-MSCs組更大。在腦梗塞移植后28d腦梗塞及周圍ECSOD、Bax、Bcl-2的表達情況:ECSOD-MSCs組較MSCs組、PBS組、Model組ECSOD表達高，差異有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);ECSOD-MSCs組、MSCs組較PBS組、Model組Bax陽性細胞數(shù)明顯少(P＜0.05)，