人三葉因子1相互作用蛋白基因的篩選.pdf

1、目的： 觀察人三葉因子1(human trefoil family factor 1，hTFFI)在人正常及胃癌組織黏膜中的表達(dá)改變；篩選人胃癌細(xì)胞eDNA文庫(kù)中hTFFl相互作用蛋白基因，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。 方法： 采用免疫組化方法測(cè)定人正常及胃癌組織胃黏膜中hTFFl的表達(dá)情況；從人正常胃黏膜提取組織總RNA，RT-PCR擴(kuò)增人hTFF1基因，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌融合質(zhì)粒pDEST32-hTFF

2、1；采用BP反應(yīng)及LR反應(yīng)構(gòu)建酵母雙雜交獵物融合質(zhì)粒pDEST22-胃癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)；將誘餌融合質(zhì)粒及獵物融合質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化Mav203酵母細(xì)胞進(jìn)行酵母雙雜交，缺陷型固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性相互作用克??；提取陽(yáng)性克隆獵物質(zhì)粒，DNA測(cè)序后，利用核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)技術(shù)分析篩選結(jié)果，明確胃癌細(xì)胞cDNA文庫(kù)中三葉因子1相互作用蛋白基因；構(gòu)建分別表達(dá)候選相互作用蛋白及hTFF1的誘餌質(zhì)粒及獵物質(zhì)粒，反向酵母雙雜交驗(yàn)證兩者之間的相互作用。

3、 結(jié)果： hTFF1在胃癌黏膜中的表達(dá)低于正常胃黏膜組織(P<0.05)；從人正常胃黏膜成功克隆了hTFF1基因，構(gòu)建了pDEST32-hTFF1酵母表達(dá)質(zhì)粒及pDEST22-胃癌細(xì)胞eDNA文庫(kù)。酵母雙雜交篩選獲得24個(gè)陽(yáng)性克隆，其中1個(gè)克隆測(cè)序成功，為FAM38A(Homo sapiens family with sequence similarity 38，member A)蛋白基因。反向雙雜交進(jìn)一步驗(yàn)證了FAM38