依維菌素免疫學檢測技術研究.pdf

1、依維菌素(IVM)是一種半合成的大環(huán)內(nèi)酯化合物，具有廣譜的抗寄生蟲和節(jié)肢動物活性，是天然殺蟲素阿維菌素結(jié)構改造產(chǎn)物，為阿維菌素族農(nóng)藥中的一員。近年來廣泛用于農(nóng)業(yè)中防治茄瓜類、葉菜類等重要害蟲，具有很好的殺蟲效果。由于其在蔬菜內(nèi)殘留量低，水溶解性小，儀器檢測的靈敏度難以達到要求。免疫學檢測技術是對農(nóng)藥及其代謝物的重要的快速分析方法，其具有靈敏度高、特異性強、方便快捷，有著儀器檢測無可比擬的優(yōu)勢。本文利用依維菌素單克隆抗體進行了免疫學檢測技

2、術的研究，主要內(nèi)容包括IVM半抗原的設計，人工抗原合成，單克隆抗體制備和相應的依維菌素ELISA檢測方法的建立，取得結(jié)果如下： 1.半抗原的改造和人工抗原的合成：用琥珀酸酐法對依維菌素C5位羥基進行化學改造，合成了半抗原IVM-5-琥珀酰半酯，再用碳化二亞胺法將其與載體蛋白(BSA、OVA)偶聯(lián)制備人工抗原。 2.依維菌素單克隆抗體的制備：以IVM-5-琥珀酰半酯與BSA的偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠，其中A2小鼠的陽性血

3、清效價最高，達到128，000。運用雜交瘤技術將A2小鼠的脾細胞與SP2/0瘤細胞融合，融合率達到78％。經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選、亞克隆、ELISA方法檢測獲得產(chǎn)生陽性抗體的雜交瘤細胞株4B6，抗體初步鑒定為IgG球蛋白。再通過體外接種經(jīng)產(chǎn)多代的Balb/c小鼠，獲得高效價的腹水單克隆抗體，效價高達512，000。 3.利用間接競爭ELISA方法建立依維菌素的免疫檢測方法：最佳工作條件優(yōu)化后，包被原稀釋800倍，腹水單克隆抗體稀釋4

4、0000倍，溶解分析物的緩沖液中添加的促溶有機溶劑為10％甲醇。建立的依維菌素CI-ELISA檢測線性檢測范圍在0.146-431.949ng/ml，最低檢測限為0.039ng/ml,抑制中濃度為7.947ng/ml。對結(jié)構類似物阿維菌素B1的交叉反應率為51％，與米比菌素肟化物的交叉反應率小于0.2％。并將依維菌素ELISA檢測方法進行了實樣檢測的初步應用，在蔬菜中添加依維菌素0-400ng/ml，回收率為90％-105％，變異系數(shù)為