PGE2高靈敏度ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的:利用純化的前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)單克隆抗體(mAb-1G)建立檢測(cè)PGE2的高靈敏度ELISA測(cè)定方法，利用此方法測(cè)定了經(jīng)典炎癥細(xì)胞模型LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌PGE2的情況。
　　 方法:采用硫酸銨沉淀法純化得到了產(chǎn)量較高的且符合實(shí)驗(yàn)要求的單克隆抗體mAb-1G。并合成了PGE2-多聚賴(lài)氨酸(PLL)以及PGE2-堿性磷酸酶(AKP)兩種偶聯(lián)物，選擇TNBS法檢測(cè)了偶聯(lián)

2、比率。然后利用純化的抗體與偶聯(lián)物共建立四種ELISA檢測(cè)方法:間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，改良型直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（比色法）以及改良型直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（熒光法）測(cè)定PGE2;建立LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，采用改良型直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（熒光法）測(cè)定經(jīng)典炎癥細(xì)胞模型LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌PGE2的情況。
　　 結(jié)果:間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，改良型直

3、接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（比色法）和改良型直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（熒光法）的檢測(cè)范圍分別為1.56～50.00μg/mL;0.63～20.00μg/mL;1.95～250.00 ng/mL;0.156～5.00 ng/mL。在細(xì)胞模型中，采用改良型直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（熒光法）測(cè)定細(xì)胞上清，結(jié)果顯示，LPS(10 ng/mL)刺激24 h后可顯著增高RAW264.7巨噬細(xì)胞PGE2的分泌，而在該模型下，中藥六類(lèi)新藥原生痛對(duì)PGE2的增加無(wú)明顯的