嵌合EGFRvⅢscFv-CD137-CD3ζ質(zhì)粒的構(gòu)建及其所修飾T淋巴細(xì)胞的選擇性殺傷作用.pdf

1、背景:以免疫效應(yīng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的過繼免疫治療(AIT)是腫瘤生物治療的重要方法之一,從實(shí)驗(yàn)室到臨床都顯現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用,日益受到人們的重視。然而對(duì)于大多數(shù)腫瘤來說,AIT并未取得滿意的治療效果,在臨床上只起輔助治療作用。嵌合抗原受體(CAR)基因修飾T細(xì)胞是近年來發(fā)展的靶向免疫治療新策略,它賦予T細(xì)胞更強(qiáng)的增殖性,持久的生命力,靶向殺傷活性,使T細(xì)胞能克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和打破宿主免疫耐受狀態(tài),為腫瘤過繼免疫治療注入了新的活力。

2、
　　表皮生長因子受體III型突變體(EGFRvIII)是腦膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中表達(dá)率很高的腫瘤特異性抗原,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,為腫瘤靶向治療理想的分子靶點(diǎn)。本課題設(shè)計(jì)第二代嵌合抗原受體EGFRvIII scFv-CD137-CD3ζ,利用EGFRvIII scFv實(shí)現(xiàn)腫瘤抗原靶向性,共刺激分子CD137增強(qiáng)T細(xì)胞活性,CD3ζ激活T細(xì)胞毒性反應(yīng)。以慢病毒介導(dǎo)CAR修飾T細(xì)胞,重定向T細(xì)胞特異性識(shí)別表達(dá)EGFRvIII的腦

3、膠質(zhì)瘤細(xì)胞,體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)其選擇性殺傷作用,為膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤的免疫治療探索新方法。
　　目的:探討嵌合EGFRvIII scFv-CD137-CD3ζ修飾T細(xì)胞對(duì)EGFRvIII陽性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向殺傷作用。
　　方法:利用基因合成方法獲得Hinge-TM-CD137-CD3ζ,應(yīng)用分子克隆技術(shù)將其克隆入慢病毒轉(zhuǎn)移載體pCDH-CMV-MCS的EcoRI和BamHI位點(diǎn),新獲得的載體命名pCDH-CD137-CD3ζ。用P

4、CR擴(kuò)增pCR2.1TOPO-EGFRvIII scFv中的EGFRvIII scFv基因序列,將其克隆入pCDH-CD137-CD3ζ的EcoRI位點(diǎn),基因連接方向的確定用菌落PCR鑒定。最后經(jīng)DNA測(cè)序鑒定,新質(zhì)粒命名為pCDH-CAR。通過磷酸鈣沉淀法將包裝質(zhì)粒pDel8.9、包膜蛋白質(zhì)粒pVSVG和含目的基因的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCDH-CAR共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞,收集病毒上清。用蔗糖超速離心沉淀法濃縮,制備成慢病毒(LV-EGFRvI

5、II/CAR),用p24 ELISA試劑盒測(cè)定病毒滴度。應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)分離、激活人外周血CD3+T淋巴細(xì)胞并用慢病毒感染,用流式細(xì)胞儀和Western blot檢測(cè)CAR在T細(xì)胞的表達(dá),51Cr釋放法檢測(cè)CAR+T細(xì)胞的選擇性殺傷作用,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌。并在裸鼠體內(nèi)驗(yàn)證其對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 EGFRvIII+U87的腫瘤抑制作用。
　　結(jié)果:DNA測(cè)序鑒定嵌合抗原受體各基因片段EGFRvIII scFv、

6、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、CD137胞內(nèi)段和 CD3ζ序列和連接正確,制備的慢病毒 LV-EGFRvIII/CAR滴度達(dá)1.8x106TU/ml,轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的效率68.73％,體外試驗(yàn)顯示CAR+T細(xì)胞對(duì)EGFRvIII+U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抗原依賴性激活和特異性的殺傷作用,共培養(yǎng)上清中檢測(cè)到顯著的IFN-γ活性,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示出CAR+T細(xì)胞對(duì)裸鼠移植腫瘤的特異性腫瘤抑制作用。
　　結(jié)論:CAR+T細(xì)胞在體內(nèi)和體外均顯示出較好的腫瘤抗原特異性