T細胞來源Exosomes調節(jié)妊娠丟失孕鼠外周T細胞功能誘導母胎免疫耐受的研究.pdf

1、目的:反復妊娠丟失指自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生3次或3次以上者，其發(fā)生率約占自然流產(chǎn)病例的3％-5％，但仍有50％-60％原因不明，稱為不明原因反復妊娠丟失(URSA)，嚴重影響著孕婦的身心健康。隨著生殖免疫醫(yī)學的發(fā)展，研究表明URSA主要與免疫因素有關，是母體對胎兒免疫排斥的結果。妊娠是一種同種異體移植，胚胎被母體的免疫機制識別并接納后，妊娠才能得以正常維持。因此，誘導母體對同種異體胎兒抗原的免疫耐受是治療的關鍵。
　　 國內外研究表明

2、當前臨床多采用免疫細胞過繼療法治療URSA，誘導母體對同種異體胚兒抗原的免疫耐受，但是這種方法存在較多的局限性。本研究采用流產(chǎn)實驗動物模型，分析T細胞來源的非細胞成分Exosomes調節(jié)妊娠丟失孕鼠外周T細胞功能以誘導母胎免疫耐受，確定分析T細胞來源Exosomes取代傳統(tǒng)“免疫細胞過繼療法”治療妊娠丟失的免疫學機制，為今后開展臨床應用奠定實驗基礎并提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、雄性無關個體脾細胞及其Exoso

3、mes的制備和初步鑒定:斷頸處死BALB/c雄鼠，無菌條件下解剖取脾組織，獲得單個細胞懸液，采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾技術獲得Exosomes;通過掃描電鏡、透射電鏡觀察Exosomes的形態(tài)、結構，紫外分光光度法測定其蛋白含量。
　　 2、妊娠丟失實驗動物模型的建立:雌雄小鼠隨機分為4組后按2∶1合籠交配;CBA/J(♀)×BALB/c（(♂)）為正常妊娠對照組(Contro組)，CBA/J(♀)×DBA/2((♂))為UR

4、SA組。再將URSA孕鼠分別于孕第4天無特殊處理，給予尾靜脈注射無關個體BALB/c雄鼠脾單個核細胞及無關個體BALB/c雄鼠脾T細胞來源的Exosomes，隨機分為妊娠丟失組(URSA組)、細胞治療組(Cellular Therapy組)、非細胞治療組(Non-cellular Therapy組)。
　　 3、胚胎發(fā)育情況的觀察:于妊娠第14天分別將各組CBA/J孕鼠處死，測量計算胎盤體積，計數(shù)各組吸收胚胎個數(shù)及存活胚胎個數(shù)，

5、根據(jù)公式計算出胚胎吸收率及妊娠丟失率。
　　 4、母胎免疫耐受狀況的分析:于妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取脾組織，制備單個脾細胞懸液。MTT染色法檢測單向混合淋巴反應、雙向混合淋巴反應中T細胞轉化的A492值。
　　 5、孕鼠外周T淋巴細胞免疫功能變化的檢測:于妊娠第14天分別處死各組CBA/J孕鼠，無菌解剖取脾組織，制備單個脾細胞懸液。直接熒光標記流式細胞計數(shù)(FCM)分別檢測T細胞表面CD3、CD

6、4、CD8、CD247、CD25、IL-17、CD28、CTLA-4的表達，分別計算CD3+、CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD3+CD247+、 CD4+CD25+、IL-17+、 CD4+CD28+、CD4+CTLA-4+細胞的百分率。
　　 6、統(tǒng)計學處理:各組數(shù)據(jù)均通過SPSS13.0版本軟件進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，采用卡方檢驗比較各組孕鼠胚胎發(fā)育情況;采用F檢驗對孕鼠T細胞免疫功能進行單因素方差分析(ANOVA

7、)，S-N-K法進一步對多個樣本均數(shù)間進行兩兩比較。
　　 結果:
　　 1、雄性無關個體脾臟T細胞來源Exosomes的初步鑒定
　　 形態(tài)及超微結構觀察及蛋白定量。掃描及透射電鏡下觀察，T細胞分泌的Exosomes為脂質雙分子層膜包圍的球體，呈橢圓形或圓形杯口狀，胞膜完整，直徑約為30nm～100nm，內為低電子密度物質。紫外分光光度法蛋白定量顯示Exosomes的A280值為0.343±0.029。

8、　　 2、不同過繼轉輸對妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響
　　 Control組孕鼠的胚胎吸收率為5.25％，URSA組為20.78％，細胞治療組、非細胞治療組分別為7.81％、3.18％。與URSA組相比，細胞治療組及非細胞治療組胚胎吸收率均顯著下降(均P＜0.01)，并且均下降至Control組水平（均P＞0.05）;非細胞治療組胚胎吸收率顯著低于細胞治療組(P＜0.05）。
　　 Control組孕鼠的妊娠丟失率為20

9、％，URSA組為62％，細胞治療組、非細胞治療組分別為22％、22％。與URSA組相比，細胞治療組及非細胞治療組妊娠丟失率均顯著下降(均P＜0.01)，且均下降至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯差異(P＞0.05）。
　　 3、母胎免疫耐受狀況的分析
　　 單向淋巴細胞混合反應，Control組、URSA組及細胞治療組、非細胞治療組孕鼠脾細胞的A492值(分別為0.584±0.060、0.6

10、97±0.035，0.411±0.024、0.313±0.191)。其中，Control組與URSA組之間明顯差異(P＜0.05);細胞治療組、非細胞治療組較之顯著下降(均P＜0.05)，細胞治療組、非細胞治療組無明顯差異(P＞0.05）。
　　 雙向淋巴細胞混合反應，Control組、URSA組及細胞治療組、非細胞治療組孕鼠脾細胞的A492值(分別為0.551±0.308、0.478±0.116，0.702±0.126、0.5

11、63±0.134)。其中，Control組與URSA組之間有明顯差異（P＜0.05）;細胞治療組較之顯著上升（P＜0.05），非細胞治療組較之無明顯差異(P＞0.05)，細胞治療組、非細胞治療組有明顯差異（P＜0.05）。
　　 4、外周T淋巴細胞功能的檢測
　　 4.1、CD4、CD8的表達變化
　　 與Control組外周T細胞CD3表達百分率(33.47％±11.78％)相比，URSA組表達百分率顯著升高(

12、43.43％±5.41％，P＜0.01);經(jīng)細胞治療、非細胞治療后無明顯變化（分別為42.17％±7.43％，41.62％±7.21％，P＞0.05），兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 與Control組外周T細胞CD4+CD8-表達百分率(23.09％±3.02％)相比，URSA組表達百分率顯著升高(29.02％±5.74％，P＜0.01);經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著降低(分別為20.25％±7.70

13、％、22.86％±8.98％，均P＜0.01)至Control組水平(均P＞0.05);兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 與Control組外周T細胞CD4-CD8+表達百分率（30.64％±1.55％）相比，URSA組表達百分率顯著降低(27.24％±1.70％，P＜0.01);經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著升高(分別為32.45％±2.12％、31.72％±0.98％，均P＜0.01)至Control組

14、水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 與Control組外周T細胞CD4/CD8表達百分率（1.04％±0.21％）相比，URSA組表達百分率顯著升高（1.50％±0.63％，P＜0.01）;經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著降低(分別為1.06％±0.11％、1.06％±0.29％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。

15、
　　 4.2、CD3+CD247+的表達變化
　　 與Control組外周T細胞CD3+CD247+表達百分率(3.77％±1.79％)相比，URSA組表達百分率顯著降低（0.13％±0.06％，P＜0.01）;經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著升高(分別為3.30％±0.99％、3.57％±0.78％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　

16、 4.3、調節(jié)性T細胞的表達變化
　　 與Control組外周T細胞CD4+CD25+表達百分率（1.68％±0.75％）相比，URSA組表達百分率顯著升高(1.26％±0.85％，P＜0.01);經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著降低(分別為2.00％±0.89％、2.10％±0.70％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 與Control組外周

17、T細胞IL-17+表達百分率(2.49％±0.14％)相比，URSA組表達百分率顯著升高(1.21％±0.11％，P＜0.01);經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著降低(分別為2.24％±0.52％、2.38％±1.02％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 4.4、正負向協(xié)同刺激因子細胞表達的變化
　　 與Control組脾細胞CD4+CD28+

18、表達百分率（4.91％±1.21％）相比，URSA組表達百分率顯著下調（1.73％±0.84％，P＜0.01）;經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著升高(分別為4.05％±1.23％、4.12％±1.28％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。
　　 與Control組脾細胞CD4+CTLA-4+表達百分率（0.82％±0.08％）相比，URSA組表達百分率顯著升高

19、（3.08％±0.37％，P＜0.01）;經(jīng)細胞治療、非細胞治療后顯著降低(分別為0.77％±0.11％、1.20％±0.30％，均P＜0.01)至Control組水平（均P＞0.05）;兩治療組組間比較無明顯統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1、過繼轉輸雄性個體外周T淋巴細胞或其分泌的非細胞成分Exosomes均可有效誘導母胎免疫耐受，過繼轉輸Exosomes可發(fā)揮更強的母胎免疫耐受誘導效應。