豬多能干細(xì)胞中LAMININ基因表達(dá)譜的分析及其可變剪切體的分子克隆.pdf

1、層粘連蛋白(Laminin，LN)是細(xì)胞膜的重要成分，采用LN作為細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)多能干細(xì)胞，可以維持干細(xì)胞的自我更新和多能性。LN家族中有15種不同的亞型，每一種亞型由三條肽鏈(α、β、γ)組成，形成十字架結(jié)構(gòu)的異源三聚體。其中LamininA5(LAMA5)對于維持多能干細(xì)胞的生長有重要作用。本研究旨在檢測豬不同組織和細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)情況，研究LN在多能干細(xì)胞分化過程中的時空表達(dá)特性;通過生物信息學(xué)分析和分子克隆，確認(rèn)豬LAM

2、A5基因的存在和表達(dá)變化;發(fā)現(xiàn)并分子克隆了與豬多能干細(xì)胞特性相關(guān)的Laminin B1-a(LAMB1-a)可變剪接體。本研究豐富了對豬多能干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)研究的信息，為研究豬干細(xì)胞多能性的維持提供了理論依據(jù)。
　　本研究獲得的主要結(jié)果如下:
　　1.LAMININ在豬組織和細(xì)胞中的表達(dá)譜分析
　　用RT-PCR檢測豬不同組織（肝臟、心臟、肺、胃、腦、睪丸、脂肪、顆粒細(xì)胞組織）、體細(xì)胞（肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、豬胎兒成纖維細(xì)胞

3、）和多能干細(xì)胞(DOX-iPS、PS11、PS23)中LAMININ不同亞型的表達(dá)情況。結(jié)果表明，不同組織和細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)存在明顯差異。通過比對組織來源和細(xì)胞來源的樣品發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特異性更加突出，其中在PEF細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特征為:LAMA45-LAMB1/2-LAMC1/2（即LN-411、 LN-421、LN-511和LN-521）;在豬iPS細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特征為:LAMA15

4、-LAMB1-a/2-LAMC1(即LN-11a1、LN-121、LN-51a1和LN-521)。
　　2.豬LAMA5的生物學(xué)分析和克隆
　　未注釋有豬LAMA5基因的序列信息和相關(guān)報道。為此我們運(yùn)用NCBI和UCSC等數(shù)據(jù)庫，分析人、牛和山羊的LAMA5基因序列，預(yù)測豬LAMA5基因，以RPS21和CABLES2基因?qū)ωi基因組數(shù)據(jù)庫(Sscrofa11.1)中LAMA5的可能序列區(qū)域進(jìn)行定位。通過DNAMAN(V6)軟件

5、進(jìn)行比對，確認(rèn)了豬LAMA5的序列，并設(shè)計特異性引物，從豬肺組織樣cDNA中克隆了長度為731 bp的豬LAMA5基因序列。測序結(jié)果與人和牛LAMA5序列高度一致，序列上傳至GENBANK，獲得登錄號:KY622023。
　　3.豬多能干細(xì)胞中LAMININ的表達(dá)特性和LAMB1-a可變剪接體的發(fā)現(xiàn)
　　通過檢測，發(fā)現(xiàn)豬iPS細(xì)胞中，LAMB1出現(xiàn)了兩條特異性條帶，為了進(jìn)一步研究LAMB1的性質(zhì)，對克隆的兩條特異性條帶（LA

6、MB1505bp、LAMB1-a639bp）進(jìn)行測序，結(jié)果顯示與NCBI中已有的LAMB1-X1和LAMB1-X2序列不一樣，發(fā)現(xiàn)LAMB1-a是一個新的可變剪接體。
　　為了進(jìn)一步探討LAMB1與多能干細(xì)胞的相關(guān)性，選取豬PEF和豬多能干細(xì)胞DOX-iPS及分化的iPS細(xì)胞進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，隨著多能干細(xì)胞形態(tài)的改變，細(xì)胞團(tuán)形態(tài)逐漸消失，LAMB1-a的表達(dá)逐漸下降，當(dāng)再次運(yùn)用DOX-iPS培養(yǎng)基培養(yǎng)后，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)再次恢復(fù)的