硒對(duì)雄鼠睪丸硒蛋白組表達(dá)及相關(guān)生殖功能的影響.pdf

1、目的：男性不育是全球性的社會(huì)與健康問題，其病因復(fù)雜，但已明確硒（Selenium，Se）缺乏和過量導(dǎo)致的精子發(fā)生過程障礙是其病因之一。硒是機(jī)體必需的微量元素，在體內(nèi)主要通過硒蛋白（Selenoproteins）的形式發(fā)揮生物學(xué)作用。目前關(guān)于機(jī)體硒缺乏或過量導(dǎo)致生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)損傷和功能下降已有不少報(bào)道，但是其具體機(jī)制尚未闡明，特別是研究機(jī)體硒水平對(duì)雄性生殖系統(tǒng)硒蛋白組表達(dá)的調(diào)控，篩選特異性功能硒蛋白，進(jìn)而探究硒對(duì)雄性生殖健康的影響尚未見報(bào)道

2、。
　　當(dāng)前，應(yīng)用硒制劑防治硒缺乏病已經(jīng)取得顯著效果，但在治療硒缺乏病時(shí)，由于盲目加大硒制劑的用藥劑量，導(dǎo)致硒中毒時(shí)有發(fā)生。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，分析雄性大鼠在不同硒營養(yǎng)水平下，睪丸組織硒蛋白組的表達(dá)特征及其潛在功能，探索Se及硒蛋白在精子發(fā)生和雄性生殖健康中的作用，為防治Se及硒蛋白相關(guān)的男性不育疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：1.實(shí)驗(yàn)方法
　　1.1.實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)
　　將30只4周齡雄性大鼠，以缺硒飼料飼喂5周，

3、建立動(dòng)物缺硒模型。隨后按體重隨機(jī)分為5組，每組6只大鼠，分別為：缺硒模型組（BD5w組）、缺硒對(duì)照組（BD9w組）、適硒組（BD+0.25 ppm Se組，記為BD+0.25組），高硒組（BD+3.0 ppm Se組，記為BD+3.0組），中毒硒組（BD+5.0 ppm Se組，記為BD+5.0組）。BD5w組在9周齡時(shí)處死取樣，余下4組以相應(yīng)硒水平繼續(xù)飼養(yǎng)4周。
　　1.2.動(dòng)物生長性能指標(biāo)測定
　　每周監(jiān)測動(dòng)物體重；動(dòng)物

4、取樣時(shí)，稱量睪丸重量，并計(jì)算睪丸指數(shù)。
　　1.3.大鼠組織、血細(xì)胞硒含量測定
　　采集心臟抗凝全血，離心得血細(xì)胞；分離睪丸、肝臟、腎臟等組織。所有樣品經(jīng)消化處理后，以電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定硒濃度。
　　1.4.大鼠血漿8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的測定
　　按照試劑盒說明，測定大鼠血漿8-OHdG水平。
　　1.5.大鼠精子質(zhì)量和電鏡觀察
　　缺硒對(duì)照組、BD+0.25組、B

5、D+3.0組、BD+5.0組等4組大鼠處死后，分離附睪尾，以精子獲能液搜集各大鼠精子，顯微鏡下觀察（×400）精子密度和精子活力，并錄下視頻；吸取1滴12％中性甲醛固定的精子懸液于載玻片上制備標(biāo)本觀察精子形態(tài)（×400）；離心精子懸液，得精子沉淀物，以2.5%戊二醛固定，常規(guī)電鏡制片，透射電鏡下觀察精子超微結(jié)構(gòu)。
　　1.6大鼠睪丸硒蛋白組基因的表達(dá)豐度測定（RT-qPCR）
　　微量勻漿器研磨小塊睪丸組織后，加入RNAis

6、o Plus試劑提取睪丸組織總RNA，制備cDNA第一鏈，以cDNA作模板，qPCR法檢測睪丸硒蛋白基因組表達(dá)水平。
　　2.統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(One Way Anova)，進(jìn)一步作組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.硒對(duì)大鼠睪丸發(fā)育的影響
　　1.1.硒對(duì)大鼠體重和睪丸指數(shù)的影響
　　大鼠飼喂缺硒和過

7、量硒（3.0和5.0 ppm Se）飼料可致大鼠生長緩慢，體重下降，體重增長速度由大到小為：BD+0.25組>BD+3.0組>BD+5.0組>缺硒對(duì)照組；BD+5.0組的睪丸重和指數(shù)均稍高于其余3個(gè)染硒組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），缺硒對(duì)照組、BD+0.25組、BD+3.0組3組睪丸重和指數(shù)沒有顯著差異（P>0.05）。
　　1.2.硒對(duì)大鼠組織硒含量的影響
　　大鼠缺硒可致睪丸、肝、腎、血細(xì)胞硒濃度明顯降低，缺

8、硒5、9周均低于適硒組（P<0.05）；缺硒狀態(tài)下，睪丸硒濃度明顯高于肝、腎、血細(xì)胞（P<0.05）；補(bǔ)充不同硒水平飼料后組織硒含量有所升高，其中肝、腎、血細(xì)胞中硒的蓄積濃度與染硒劑量呈明顯正相關(guān)，隨著染硒劑量的增加而迅速升高，而睪丸硒濃度隨著染硒劑量的增加升幅較小，在3.0 ppm Se以上染硒劑量時(shí)，睪丸硒濃度增速趨于平緩。
　　1.3.硒對(duì)大鼠血漿8-OhdG水平的影響
　　各染硒組8-OHdG水平表現(xiàn)為：缺硒對(duì)照組>

9、BD+5.0組>BD+3.0組>BD+0.25組，其中缺硒對(duì)照組與BD+0.25組、BD+3.0組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），BD+0.25組、BD+3.0組、BD+5.0組3組間差異不顯著（P>0.05）。
　　2.硒對(duì)大鼠精子質(zhì)量和超微結(jié)構(gòu)的影響
　　2.1.精子質(zhì)量
　　精子密度：各硒干預(yù)組由高至低依次為：BD+0.25組>BD+3.0組>BD+5.0組>缺硒對(duì)照組，其中BD+0.25組是缺硒對(duì)照組

10、的1.75倍（P<0.05），BD+3.0組是缺硒對(duì)照組的1.57倍（P<0.05）。
　　精子活力：前向運(yùn)動(dòng)精子活力方面，BD+0.25組明顯高于缺硒對(duì)照組（P<0.05），BD+3.0組、BD+5.0組亦高于缺硒對(duì)照組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；非前向運(yùn)動(dòng)精子活力方面，缺硒對(duì)照組明顯高于BD+0.25組、BD+3.0組、BD+5.0組（P<0.05）；精子總活力方面，未發(fā)現(xiàn)缺硒對(duì)照組和3個(gè)補(bǔ)硒組間有顯著差異（P>0

11、.05）。
　　精子形態(tài)：BD+5.0組精子畸形率最高，缺硒對(duì)照組其次，BD+0.25組和BD+3.0組結(jié)果相近。BD+5.0組和BD+0.25組、BD+3.0組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與缺硒對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　2.2.精子超微結(jié)構(gòu)
　　缺硒對(duì)照組（BD9w組）大鼠精核膜出現(xiàn)核周隙，頂體未見，精子中段細(xì)胞膜褶皺；線粒體部分區(qū)域排列紊亂，出現(xiàn)空隙，部分線粒體有明顯空變。適硒

12、組（BD+0.25組），精子頭部精核膜完整，尾段胞膜完整光滑，線粒體呈同心圓排列，結(jié)構(gòu)致密，大部分形態(tài)、大小正常，線粒體空變數(shù)量有所減少；軸絲和外周致密纖維規(guī)律排列整齊。高硒組（BD+3.0組），精子頭部精核膜完整，頂體不明顯，精子中段多見巨大線粒體，部分線粒體空變，最外層胞膜消失；精子尾段外圍出現(xiàn)線粒體部分松解，界限不清。硒中毒組（BD+5.0組），精子頭部細(xì)胞膜出現(xiàn)皺褶，頂體不明顯，外周9條致密纖維部分缺失，精子中段細(xì)胞膜不清晰，線

13、粒體大部分空變；精子尾段纖維鞘部分松散，線粒體丟失，細(xì)胞膜不清晰?？傮w來看，硒中毒組和缺硒對(duì)照組精子超微結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重，高硒組次之。而適硒組雖然一定程度上恢復(fù)了缺硒所致的精子超微結(jié)構(gòu)損傷，但仍存留有部分損傷不可恢復(fù)。
　　3.硒對(duì)大鼠睪丸硒蛋白組基因表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)采用RT-qPCR方法對(duì)大鼠睪丸組織硒蛋白組基因進(jìn)行定量檢測。研究結(jié)果顯示，缺硒可致硒蛋白基因表達(dá)普遍下調(diào)，給予大鼠補(bǔ)充不同劑量的硒飼料后，共發(fā)現(xiàn)10個(gè)基因

14、mRNA表達(dá)豐度上調(diào)，并且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，在BD+0.25組達(dá)到最高表達(dá)的基因有6個(gè)（Gpx1、SnGpx4、Txnrd2、Dio1、Seli、Sepn1），BD+3.0組3個(gè)（Selr、Sepp1、Sepw1），BD+5.0組1個(gè)（Txnrd1），組間表達(dá)差異達(dá)到2倍以上并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因有6個(gè)（Gpx1、SnGpx4、Txnrd1、Txnrd2、Seli、Selr），Txnrd1、SnGpx4、Selr是對(duì)硒調(diào)控最敏

15、感的硒蛋白基因。
　　結(jié)論：1.硒缺乏和過量（3.0和5.0 ppm Se）可致大鼠發(fā)育減緩，DNA氧化損傷，精子生成障礙，精子結(jié)構(gòu)損傷、前向運(yùn)動(dòng)活力下降、畸形率升高，并且下調(diào)多個(gè)睪丸硒蛋白基因的表達(dá)；
　　2.補(bǔ)充0.25 ppm Se飼料可改善大鼠發(fā)育狀況，降低DNA氧化損傷程度，有效恢復(fù)精子結(jié)構(gòu)損傷，提升精子質(zhì)量，以及上調(diào)睪丸硒蛋白組基因表達(dá)；
　　3.大鼠在硒缺乏和過量狀態(tài)下，睪丸硒蛋白表達(dá)異?？芍戮淤|(zhì)量下降