人剪切修復基因XPD對肝癌SMMC-7721細胞生長抑制的研究.pdf

1、目的:研究表明，野生人剪切修復基因著色性干皮病基因D（Xeroderma Pigmentosum D，XPD）在重要的DNA修復路徑--核苷酸切除修復中有關鍵作用，是DNA修復路徑中的重要因子。XPD發(fā)生基因突變時，腫瘤的易感性會增高。本課題主要研究野生型XPD基因對肝癌SMMC-7721細胞生長的影響，探討XPD基因抑制肝癌SMMC-7721細胞生長的機理。 方法用堿裂解法從制備好的大腸桿菌中提取空載質粒pEGFP-N2及重組

2、質粒pEGFP-N2-XPD，并用KPN1、BGIⅡ和SPHⅠ對提取出的質粒進行酶切鑒定。實驗分三組，重組質粒XPD-N2組、以空載質粒N2，及用與XPD-N2、N2具有相同遺傳背景和代數(shù)的肝癌SMMC-7721細胞作為兩個空白對照組。用脂質體分別瞬時轉染三組細胞。并在熒光顯微鏡下檢測轉染后綠色熒光蛋白基因表達情況。使用流式細胞儀監(jiān)測細胞周期，統(tǒng)計細胞各周期的百分率。提取三組細胞總RNA，合成cDNA，用聚合酶鏈反應（PCR）檢測三組細

3、胞中p27、Cdk2及Cdk7表達情況，Western blot法檢測細胞中p27、Cdk2及Cdk7表達量變化，在96孔板中進行MTT試驗以觀察細胞增殖的活力變化。 結果1、提取出的重組質粒pEGFP-N2-XPD用酶切鑒定，進行電泳色帶與Genebank中公布的人類XPD完整mRNA序列NM_000400分析預期相吻合。2、轉染質粒后40h，在熒光顯微鏡下觀察到在SMMC-7721-pEGFP-N2，SMMC-7721-pE

4、GFP-N2-XPD兩組中有綠色熒光蛋白的表達。3、流式細胞儀監(jiān)測到與其它兩對照組相比，轉染了pEGFP-N2-XPD重組質粒的肝癌細胞數(shù)進入S期明顯減少，停滯在G1期。4、應用RT-PCR、Western blot檢測 SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD細胞與SMMC-7721-pEGFP-N2、SMMC-7721兩對照組顯示：其XPD表達明顯升高（P<0.05）。p27相對表達量升高（P<0.05），Cdk7相對表達量明顯