四分子交聯(lián)體5與大腸癌轉(zhuǎn)移的關系.pdf

1、大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命健康。本研究用基因芯片技術篩選三株具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞株的差異表達基因，從中挑選出Tspan-5作為研究對象，從分子和細胞水平深入探討該基因?qū)Y(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響，旨在研究對大腸癌轉(zhuǎn)移相關基因，不僅有利于闡明大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制，而且還能為臨床上預測轉(zhuǎn)移、基因治療和預后判斷尋找新的有效靶點。 一、基因芯片技術篩選三株具不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細胞株的差異表達基因，確定研究目

2、的基因，驗證基因芯片檢查結(jié)果 1、確定三個細胞株轉(zhuǎn)移能力的差異用異質(zhì)粘附實驗和趨化運動實驗確定LST-R1、SW480和Lovo三個細胞株之間轉(zhuǎn)移能力的差異。異質(zhì)粘附實驗的粘附介質(zhì)用collagenIV，細胞濃度為1×108／L，37℃、50mL／LCO2孵育1h。趨化運動實驗用8μm孔徑的transwell小室，趨化因子用NIH3T3細胞培養(yǎng)上清制備，調(diào)整細胞濃度為1×108／L，按200μL／上室加入細胞懸液，下室每室加50

3、0μLNIHSTS細胞培養(yǎng)上清，37℃、50mL/CO2孵育6h。結(jié)果顯示，LoVo、SW480和LST-R1三個細胞株基底膜粘附性有差異，F(xiàn)=84.279，P<0.001。其中，LST-R1粘附細胞數(shù)顯著少于LoVo(P<0.001)和SW480(P<0.001)，LoVo的粘附細胞數(shù)多于SW480(P<0.01)。粘附性強弱順序為LST-R1

4、。其中，LST-R1運動性弱于LoVo和SW480(P<0.001)，SW480運動性弱于LoVo(P<0.001)。運動性強弱順序為LST-R12或個<2而另個>10；信號值變異系數(shù)<0.33；信號平均值有2倍以上表達差異作為判定基因差異表達的標準。在顯著表達上調(diào)的基因中與轉(zhuǎn)移相關的基因主要有：發(fā)動蛋白

5、2(Dynamin2)、ADP-核糖基化因子1(ARF1)。在顯著下調(diào)表達的基因中，與轉(zhuǎn)移有關系的有跨膜4超家族成員9(transmenbrance4superfamily9，TM4SF9)，又稱四分子交聯(lián)體5(Tetraspan-5)。Tspan-5在結(jié)腸癌中的表達，為本研究首次報道，選擇該基因作為研究對象。 3、基因水平驗證基因芯片結(jié)果用半定量RT-PCR技術，結(jié)果顯示Tspan-5mRNA在三個細胞株中的表達水平差異與基因

6、芯片檢測結(jié)果相符。 4、蛋白水平驗證基因芯片結(jié)果細胞免疫化學技術定性，免疫印跡技術、免疫熒光技術結(jié)合流式細胞儀技術定量研究。結(jié)果顯示TSpan-5蛋白表達水平差異與基因芯片檢測結(jié)果相符。 5、臨床大腸癌組織樣本免疫組化研究：Tspan-5表達水平在正常大腸粘膜和息肉呈低表達或陰性，在有不典型增生的腺瘤組織中，Tspan-5表達相對于正常大腸粘膜和息肉開始升高，而在大腸癌組織中顯著升高，同時轉(zhuǎn)移癌的表達水平高于原發(fā)癌(Z=

7、109.859，P<0.001)。Tspan-5表達水平高的病人3年生存率低于Tspan-5表達水平低的病人(X2=6.237，P=0.013)。 二、體外實驗觀察改變Tspan-5表達水平對結(jié)腸癌細胞株轉(zhuǎn)移相關生物學行為的影響 1、克隆LoVo細胞Tspan-5基因，轉(zhuǎn)染LST-R1細胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞系構(gòu)建Tspan-5／pEGFP-C1重組質(zhì)粒，用Lipofectamine2000TM.轉(zhuǎn)染入LST-R1細胞，同

8、時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒做對照。轉(zhuǎn)染后的LST-R1細胞在300μg／mLG418培養(yǎng)環(huán)境里穩(wěn)定存活。Western-Blot檢測顯示轉(zhuǎn)染Jspan-5／pEGFP-C1重組質(zhì)粒的LST-R1中有Tspan-5-GFP融合蛋白表達，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1質(zhì)粒的LST-R1細胞則無。激光共聚焦顯微鏡證明表達的Tspan-5GFP融合蛋白定位在細胞膜上，而GFP蛋白則定位在胞漿。 2、RNAi下調(diào)LoVo細胞Tspan-5表達設計

9、shRHA片段，構(gòu)建質(zhì)粒，用Lipofectamine2000TM導入LoVo細胞中，構(gòu)建穩(wěn)定細胞系，干擾Tspan-5表達。免疫蛋白印跡檢測證明干擾成功，LoVoTspan5／453和LoVoTspan-5／372細胞Tspan-5蛋白表達水平顯著下降。選擇干擾效果最明顯的LoVoTspan5／453進行下一步研究。 3、異質(zhì)粘附實驗實驗結(jié)果顯示：改變Tspan-5表達水平后，細胞基底膜主要成份CollagenIV、FN、LN

10、、VN粘附能力均發(fā)生改變，上調(diào)Tspan-5表達可增強細胞基底膜粘附性，下調(diào)Tspan-5表達則降低細胞的基底膜粘附性，其中改變Tspan-5表達水平對CollagenIV的粘附能力降低最明顯。 4、趨化運動實驗實驗結(jié)果顯示：改變Tspan-5表達水平后，細胞CollagenIV、FN、LN、VN趨化運動能力均發(fā)生改變，以CollagenIV為明顯。上調(diào)Tspan-5表達可增強細胞運動性，下調(diào)Tspan-5表達則降低細胞的運動性

11、。 5、劃痕實驗實驗結(jié)果顯示：改變Tspan-5表達水平后，大腸癌細胞在CollagenIV上的劃痕愈合能力發(fā)生改變，下調(diào)Tspan-5表達可顯著抑制大腸癌細胞在CollagenIV上的劃痕愈合能力。 三、整合素與Tspan-5的相互作用 l、整合素功能阻斷和激活單獨阻斷整合素β1和Tspan-5表達，LoVo細胞的CollagenIV粘附能力下降分別為65％和55％，聯(lián)合阻斷后，LoVo細胞的CollagenI

12、V粘附能力下降64％：單獨激活整合素β1表達，LoVo細胞的CollagenIV粘附能力上升40％，激活已阻斷Tspan-5表達的LoVo細胞，其CollagenIV粘附能力上升38％。聯(lián)合阻斷Tspan-5和整合素β1，其抑制LoVo細胞的CollagenIV粘附能力的作用沒有明顯疊加；阻斷Tspan-5的表達，對激活整合素β1的LoVo的CollagenIV粘附能力無明顯影響。此研究結(jié)果提示，Tspan-5對大腸癌細胞的Collag

13、enIV粘附能力的主要與整合素β1有關。 2、Western-Blot敲低Tspan-5表達對整合素β1的表達無顯著影響，但可以顯著抑制PIP2的表達。 3、免疫共沉淀大腸癌細胞株LoVo和SW620中，整合素β1可以被Tspan-5抗體沉淀。 4、免疫熒光雙染色Tspan-5和整合素β1在大腸癌細胞株LoVo和SW620中存在共定位。 四、體內(nèi)實驗觀察Tspan-5敲除對大腸癌細胞裸鼠肝轉(zhuǎn)移能力的影響脾

14、臟保留法建立裸小鼠肝臟轉(zhuǎn)移模型，用LoVoTspan-5／N和LoVoTspan-5／453細胞，3周處死小鼠，HE染色，光鏡下見癌細胞呈團塊狀分布，無腺腔樣結(jié)構(gòu)，胞漿豐富，核大不規(guī)則，核仁明顯，可見多核瘤巨細胞，核分裂像易見，符合低分化腺癌的結(jié)構(gòu)特征(圖3-9)。雖然敲除Tspan-5表達未能阻止轉(zhuǎn)移發(fā)生，但是LoVoTspan-5／453組肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)低于LoVoTspan05／N(Z=-2.259，P<0.001) 通過

15、以上研究可以得出以下結(jié)論： 1、LST-R1、SW480及LoVo細胞株具有不同轉(zhuǎn)移潛能，LoVo>SW480>LST-R1。 2、LST-R1、SW480、LoVo細胞Tspan-5表達水平有差異，LoVo>SW480>LST-R1。 3、Tspan-5的表達水平與大腸癌的進展呈正相關，Tspan-5表達高的病人3年生存率低于Tspan-5表達水平低的病人； 4、改變Tspan-5表達水平可以改變結(jié)腸癌