多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的表達以及亞甲藍在Sepsis中作用機制的研究.pdf

1、目的:感染性休克是一種以全身炎癥反應為線索,細胞功能障礙,壞死為結果的休克。它可導致超氧陰離子及一氧化氮(NO)的產(chǎn)生增加。超氧陰離子與NO合成過亞硝酸鹽(ONOO-),過亞硝酸鹽可使細胞DNA的裂解,出現(xiàn)多聚(ADP.核糖)聚合酶[Poly(ADP-Ribose)Polymerase,PARP]的活化,PARP的活化可顯著降低其底物輔酶Ⅰ[NicotinamideAdenine Dinucleotide,NAD+]在細胞內(nèi)的濃度,減慢

2、糖酵解和電子傳遞的速度,從而減少三磷酸腺苷(ATP)的合成,這一過程將導致細胞功能障礙和細胞死亡。
　　 多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-Ribose)Polymerase,PARP]結構:多聚(ADP-核糖)聚合酶是一種蛋白修飾酶及核苷酸聚合酶,在真核生物細胞核中含量豐富。多聚(ADP-核糖)聚合酶是分子量為116KDa的蛋白質(zhì)。它的結果包括DNA結合N端區(qū),中央自我修飾區(qū)以及C端催化區(qū)。這種酶的基本結構在真核生

3、物中具有高度的保守一致性,其中人與鼠有92％的氨基酸序列具有同源性。在不同的物種,C端催化區(qū)同樣顯示了相當高的同源性。目前發(fā)現(xiàn)了PARP存在至少6個成員:PARP-1、PARP-2、PARP-3、PARP-4/VPARP、Tankyrase-1以及-2。最常見的亞型,就是,PARP-1。
　　 休克時組織細胞缺氧的監(jiān)測和及時糾正早已倍受臨床醫(yī)生重視,而且有確切證據(jù)支持通過早期積極增加全身氧輸送可以改善患者預后。但是較多的研究發(fā)現(xiàn)

4、在感染性休克晚期當組織細胞功能已經(jīng)嚴重受損時,增加全身氧輸送的治療策略難以改善患者的預后。所以我們最想知道的是掩蓋在全身血流動力學指標“正?；敝?組織和細胞到底發(fā)生了什么變化?Trzeciak和Rivers把休克上述的改變歸納為:
　　 (1)全身性組織缺氧;
　　 (2)廣泛性內(nèi)皮細胞損傷；
　　 (3)凝血系統(tǒng)活化；
　　 (4)微循環(huán)和線粒體窘迫綜合癥(mirerocirculation and

5、 mitochondrial disress syndrome,MMDS)。
　　 其中最受關注的兩個問題,一個是以線粒體功能異常為核心細胞氧利用障礙,二、微循環(huán)功能障礙。PARP的過度活化是介導臟器組織損傷和器官功能障礙的一個關鍵終末效應機制,在線粒體功能障礙的發(fā)生機制中起到中心作用。PARP無論是在早期的器官功能障礙以及SIRS(SystemicInflammatory Response Syndrome)所導致的多器官功能

6、衰竭中,均起著至關核心的作用。
　　 大量的文獻同樣支持這個觀點:在危重病人中,PARP是一個治療干預的重要目標。
　　 在膿毒癥及感染性休克中,亞甲藍存在如下機制:
　　 (1)亞甲藍通過可以通過抑制iNOS的活性從而減少NO的產(chǎn)生,并抑制NO發(fā)揮效應的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),使環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)降低,逆轉(zhuǎn)休克時的心血管功能紊亂,避免異常釋放NO。
　　 (2)在臨床應用上也發(fā)現(xiàn)亞甲藍在人體內(nèi)

7、可直接清除氧自由基,對組織細胞可提供多途徑的保護作用和逆轉(zhuǎn)細胞壞死的作用。NO與超氧陰離子可迅速發(fā)生反應,生成過亞硝酸鹽(ONOO-),ONOO-。進一步酸化而發(fā)揮強大的氧化作用。目前已明確ONOO-病理損傷機制是與核酸作用而引起DNA的裂解,導致PARP的活化,PARP大量消耗NAD+,減慢電子傳遞和ATP形成的速率。PARP引起線粒體能量代謝障礙,導致細胞損傷甚至死亡。動物實驗已發(fā)現(xiàn)ONOO-參與介導了中毒性休克、缺血再灌注損傷等危

8、重病病理過程。
　　 亞甲藍的作用機制就是減少NO的合成以及超氧陰離子的含量。因此從機制上可以從源頭上,切斷這條PARP的途徑,從而達到改善組織細胞壞死的作用。
　　 本研究通過大鼠盲腸結扎穿孔(CLP)復制膿毒癥模型,探討多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的表達以及以及亞甲藍在Sepsis中作用機制的研究。
　　 目的：(1)通過研究多聚(ADP-核糖)聚合酶[Poly(ADP-Ribose)Polyme

9、rase,PARP]在Sepsis大鼠表達,以闡明多聚(ADP-核糖)聚合酶在Sepsis的發(fā)生發(fā)展中所起到的作用。(2)Sepsis前應用亞甲藍,以研究亞甲藍對PARP表達及活性的影響。探討亞甲藍是否是通過干預PARP途徑,降低PARP的生成,改善組織紐胞的壞死。亞甲藍作為一種價廉、多位點作用的藥物,它對膿毒癥的治療有一定突破,但其確切作用機制尚需進一步明確。
　　 方法:
　　 本研究應用盲腸結扎穿孔法(Cecal

10、Ligation and Puncture,CLP)復制膿毒癥動物模型,選取清潔級、健康、雄性Sprague-Drawley大鼠30只,體重200-250g(河北醫(yī)科大學實驗動物中心)實驗分組:30只大鼠隨機分為3組,每組10只。Ⅰ組:實驗對照組(假手術組):只開腹翻動腸管,關腹,不結扎和穿孔盲腸,術前陰莖背靜脈注射生理鹽水0.8ml。;Ⅱ組:膿毒癥模型組:術前經(jīng)陰莖背靜脈注射生理氯化鈉溶液0.8ml,注射后進行CLP手術;Ⅲ組:亞甲藍

11、干預組:術前經(jīng)陰莖背靜脈注射10％亞甲藍(15mg/kg、平均注射劑量為0.8ml),注射后進行CLP手術。術后18小時開腹觀察腹腔炎癥反應情況,分別留取肺下葉、小腸腸管、腎。實驗方法:(1)免疫組織化學法:10％多聚甲醛固定24小時,脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,連續(xù)切片3μm厚。使用SABC法免疫染色。切片分別滴加抗大鼠PARP-1抗體(1:200)4℃孵育過夜。PPS洗片后,加羊抗鼠抗體,顯色后。顯微鏡觀察,每張標本切片取隨機取樣,

12、PARP-1免疫染色評分直接計算每個視野下陽性細胞染色數(shù)目。(2)取每組大鼠小腸腸管,采用Western Blotting法檢測PARP-1蛋白(分子量116000)定量。
　　 采用SPSS13.0版軟件包(SPSS Company,.Chicago,Illinois,USA)應用完全單因素方差分析對于Western blot結果進行統(tǒng)計學分析,比較三組PARP-1水平,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗對

13、于免疫組織化學法檢測的結果進行統(tǒng)計學分析,比較三組PARP-1水平,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1:實驗對照組大鼠麻醉后清醒活動基本如常;膿毒癥組大鼠術后有嚴重的膿毒癥表現(xiàn):動物術后蘇醒延遲,逐漸出現(xiàn)精神萎靡、豎毛、寒戰(zhàn)、呼吸急促,呼吸困難及眼角分泌物等表現(xiàn),剖腹可見渾濁膿血性滲液、惡臭、腸管水腫、肝腎充血水腫,而亞甲藍干預組動物術后表現(xiàn)較輕。
　　 2:免疫組化結果:本實驗對于三組大鼠

14、的腎臟、肺臟、小腸進行PARP-1活性表達的監(jiān)測。我們發(fā)現(xiàn)在3個組織中,PARP-1表達比較。實驗對照組、亞甲藍組、膿毒癥模型組通過應用統(tǒng)計學秩轉(zhuǎn)換非參數(shù)檢驗,三組之間存在統(tǒng)計學差異P＜0.05。進行組組間的比較:實驗對照組與亞甲藍組及膿毒癥模型組PARP-1表達存在明顯差異(P＜0.05)。亞甲藍干預組與膿毒癥模型組PARP-1表達存在明顯差異(P＜0.05)
　　 3:Western blot結果:PARP-1表達比較,實驗

15、對照組、亞甲藍組、膿毒癥模型組通過應用統(tǒng)計學方差分析,三組之間存在統(tǒng)計學差異F291.89(P＜0.05)。進行組組間的比較:實驗對照組與亞甲藍組及膿毒癥模型組PARP-1表達存在明顯差異(P＜0.05)。亞甲藍干預組與膿毒癥模型組PARP-1表達存在明顯差異(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1:本實驗采用CLP方法可成功復制腹腔感染導致膿毒癥大鼠動物模型。
　　 2:通過免疫組化的方法,可檢測到膿毒癥、亞

16、甲藍組大鼠與實驗對照組相比在小腸、腎臟、肺中PARP-1陽性表達較對照組明顯增強。此說明在膿毒癥大鼠中,在關鍵臟器中PARP-1陽性表達增強。此與文獻中研究結果相同,且在國外文獻的研究結果PARP.1在膿毒癥中組織損傷壞死起到關鍵中心作用。而且亞甲藍組與膿毒癥組比較,在多臟器組織標本中,陽性表達有所下降。此說明亞甲藍可以降低PARP的表達,達到改善多個臟器組織細胞壞死的作用。
　　 3:通過Western blot可檢測到亞甲藍