轉(zhuǎn)染人熱休克蛋白70基因（hHSP70）對(duì)大鼠同種異體移植血管病的影響.pdf

1、本研究采用顯微外科技術(shù)，成功建立大鼠頸部同種異體移植血管模型。以人熱休克蛋白70(hHSP70)基因?yàn)槟康幕?，重組5型腺病毒為載體，制備轉(zhuǎn)染液，對(duì)離體供血管進(jìn)行外源性基因修飾，移植血管成功表達(dá)hHSP70基因。hHSP70基因表達(dá)產(chǎn)物能有效地增加移植血管SOD、NADPH氧化酶的活性，下調(diào)MPO的活性，抑制細(xì)胞的凋亡，明顯減輕移植血管的缺血再灌注損傷。腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染移植血管后表達(dá)基因產(chǎn)物，能夠下調(diào)黏附分子(ICAM-1

2、、VCAM-1)及其調(diào)節(jié)因子(NF-kB)的轉(zhuǎn)錄；抑制細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的分泌；減少生長(zhǎng)因子(PDGF，F(xiàn)GF，IGF-1)的表達(dá)；增加血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染人熱休克蛋白70(hHSP70)基因通過(guò)表達(dá)基因產(chǎn)物保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制平滑肌細(xì)胞的增生和遷移，減輕各種免疫和非免疫因素的影響，對(duì)同種異體移植血管病有明顯的預(yù)防作用。充分發(fā)揮機(jī)體保護(hù)性基因的作用可成為預(yù)防同種異體血管病的一種新策略。 第一部分大

3、鼠同種異體移植血管病的動(dòng)物模型的建立目的：研究建立大鼠同種異體移植血管病變模型，便于展開系列研究。方法SD大鼠為供體，Wistar大鼠為受體，采用顯微外科技術(shù)將供體的頸總動(dòng)脈原位移植于受體大鼠。分別于術(shù)后1、7、14、21、28、35天摘取受體移植血管，觀察移植血管在活體的搏動(dòng)情況，光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察移植血管的組織病理改變。結(jié)果：完成50例移植模型，成功率100％，均長(zhǎng)期存活。平均手術(shù)時(shí)間45分鐘，吻合頸總動(dòng)脈時(shí)間15分鐘。術(shù)后

4、1-3天主要出現(xiàn)內(nèi)皮受損，功能下降及隨后的不同程度的修復(fù)，一周開始移植血管有明顯的病理改變，內(nèi)皮再次受損，中層血管平滑肌細(xì)胞開始遷移和增殖；二周開始血管內(nèi)膜增殖形成，至四周血管病變完全形成。五～六周時(shí)最明顯，管腔已基本堵塞，移植血管失去功能。結(jié)論：應(yīng)用顯微外科技術(shù)成功建立同種異體移植血管模型，手術(shù)操作簡(jiǎn)單，無(wú)明顯并發(fā)癥；SD和Wistar大鼠間的血管移植是符合同種異體移植血管的病理改變的，適用于心臟移植及其他器官移植術(shù)后血管病變的研究。

5、 第二部分腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染液的制備目的：研究腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染液的制備。方法通過(guò)pDC316-HSP70質(zhì)粒的構(gòu)建，利用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生重組腺病毒，經(jīng)過(guò)毒種的鑒定，生產(chǎn)和純化，最后進(jìn)行滴度測(cè)定。結(jié)果序列測(cè)定結(jié)果重組質(zhì)粒pDC316-HSP70與GeneBank的登記序列一致，為人熱休克蛋白70基因，質(zhì)粒構(gòu)建正確，重組病毒攜帶HSP70基因。結(jié)論成功構(gòu)建攜帶hHSP70基因的重組腺病毒

6、載體能在239細(xì)胞系中包裝成具有感染性的重組腺病毒，為其應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染對(duì)同種異體移植血管缺血再灌注損傷的影響目的：觀察腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠同種異體移植血管缺血再灌注損傷的影響并探討其可能作用機(jī)制。方法總共40對(duì)大鼠，平均分為四組，(n=10)，A.假手術(shù)對(duì)照組；B.空白載體對(duì)照組；C.空白對(duì)照組；D.hHSP70基因轉(zhuǎn)染組。采取直接浸泡轉(zhuǎn)染法對(duì)供體血管進(jìn)行外源性修飾，移

7、植后8小時(shí)切取移植血管，檢測(cè)hHSP70基因表達(dá)，觀察及測(cè)定移植血管損傷及保護(hù)效應(yīng)指標(biāo)。結(jié)果基因轉(zhuǎn)染組外源性hHSP70基因成功表達(dá)。與對(duì)照組比較，基因轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮細(xì)胞受損明顯減輕，凋亡明顯減少；炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減弱；SOD及NADPH氧化酶的含量及活性升高(p<0.01)；MPO的含量及活性明顯下降(p(0.01)。結(jié)論”腺病毒介導(dǎo)的hHSP70基因能成功地轉(zhuǎn)染至局部移植血管并進(jìn)行表達(dá)；hHSP70基因?qū)刖植恳浦惭苣苡行У匾种埔浦惭?/p>

8、管的缺血再灌注損傷。 第四部分腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染對(duì)同種異體移植血管病的影響目的：觀察腺病毒介導(dǎo)hHSP70基因轉(zhuǎn)染對(duì)同種異體移植血管病的影響及探討其可能作用機(jī)制。方法總共30對(duì)大鼠，平均分為三組：A.空白載體對(duì)照組，B.空白對(duì)照組，C.hHSP70基因轉(zhuǎn)染組。將供體血管浸泡在上述不同成分的肝素生理鹽水中30分鐘，隨后建立模型。術(shù)后35天切取血管進(jìn)行基因表達(dá)及移植血管損傷的檢測(cè)。結(jié)果基因轉(zhuǎn)染組外源性hHSP70基因成功

9、表達(dá)。光鏡及電鏡下觀察基因轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，移植血管腔更為通暢，內(nèi)皮細(xì)胞損傷小，中層平滑肌細(xì)胞增生減輕，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析移植動(dòng)脈內(nèi)膜與中層的比例減少；各種分子指標(biāo)基因轉(zhuǎn)染組組與對(duì)照組比較，細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的分泌抑制，生長(zhǎng)因子(PDGF，F(xiàn)GF，IGF-1)的表達(dá)減少，黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)及其調(diào)節(jié)因子(NF-kB)的表達(dá)下調(diào)，TUNEL檢測(cè)平滑肌凋亡指數(shù)上升。 結(jié)論：腺病毒介導(dǎo)的