熱休克蛋白90抑制劑對未分化甲狀腺癌增殖及攝碘動力學的影響.pdf

1、背景與目的：
　　 未分化甲狀腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）惡性程度很高，預后極差，早期即可發(fā)生周圍組織浸潤和遠處轉移，且進展迅速，外照射治療雖可暫時緩解但極易復發(fā)，經典的化療方案收效甚微。研究發(fā)現(xiàn)，在體內作為分子伴侶的熱休克蛋白90（heat shock protein90，HSP90）對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，正逐漸成為腫瘤治療的新靶點。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-

2、Allylamino-17-demethoxy geldanamycin，17-AAG）是一種特異性的HSP90抑制劑，在體內可阻斷腫瘤賴以生存的信號通路網絡。本研究旨在通過體外細胞培養(yǎng)的方法，探討17-AAG對人ATC細胞增殖及凋亡等的影響，并分析其可能的作用機制。
　　 鈉碘轉運體（sodium/iodide symporter，NIS）位于甲狀腺濾泡細胞膜上，其功能是促進碘的主動轉運。將NIS全長DNA轉染入ATC細胞后可

3、誘導NIS的表達增高，進而促進腫瘤細胞對碘的攝取。但由于腫瘤細胞攝取的碘不能進行有機化，導致細胞內碘迅速外流。本研究的目的是了解17-AAG對已轉染NIS基因的ATC細胞攝碘動力學的影響，為這一基因工程與核素治療相結合的方案將來逐漸過渡到臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.對人ATC細胞系FRO進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。在96孔板中加入不同濃度梯度（0.1～10μM）的17-AAG，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72h后

4、，MTT法檢測各濃度組細胞在不同時間點的生長抑制率。
　　 2.收集分別經0.1μM、1μM和10μM的17-AAG作用后繼續(xù)培養(yǎng)48h的FRO細胞，PI進行DNA染色，流式細胞儀檢測各期細胞的比例；Anncxin-V-FITC及PI雙重染色，流式細胞儀檢測凋亡細胞所占的比例，計算凋亡率。
　　 3.提取經1μM的17-AAG作用48h后的FRO細胞的總蛋白，Western-blot檢測17-AAG作用前后FRO細胞內H

5、SP90、癌蛋白pAkt、Raf-1等表達的變化。
　　 4.堿裂解法提取已構建好的重組質粒pcDNA3.1-hNIS，并用限制性內切酶法對其進行鑒定。
　　 5.脂質體轉染法將質粒轉染入FRO細胞中，轉染后24h通過瞬時攝125Ⅰ能力的測定初步驗證轉染效率。
　　 6.G418抗性篩選以獲得穩(wěn)定表達細胞系hNIS-FRO。
　　 7.往hNIS-FRO細胞的培養(yǎng)基中引入125Ⅰ，進行125Ⅰ內流及外流的

6、系列實驗，繪制時間.放射性曲線；并與未轉染組進行對比。
　　 8.分析經1μM的17-AAG作用24h后hNIS-FRO細胞125Ⅰ內流及外流的變化，并與未經藥物治療的對照組進行對比研究。
　　 結果：
　　 1.經不同濃度的17-AAG作用24、48及72h后，細胞生長抑制率呈量效及時效依賴性。0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μM的17-AAG作用72h后的細胞生長抑制率分別為35.9％、40.8％、5

7、4.2％、63.9％、68.3％、73.6％和78.1％。
　　 2.經17-AAG作用48h后，隨著藥物濃度增大，G0/G1期細胞明顯增多，S期和G2/M期細胞逐漸減少，細胞周期阻滯效應呈劑量依賴性：對照組以及經0.1、1、10μM的17-AAG作用48h的各治療組間的細胞凋亡率存在明顯差異。
　　 3.與對照組相比，經1μM的17-AAG作用48h后的FRO細胞HSP90表達上調，癌蛋白pAkt、Raf-1等表達明顯

8、下調。
　　 4.重組質粒的酶切產物在5502bp和1922bp處形成兩條清晰條帶，可以證實本實驗所提取質粒確實為pcDNA3.1-hNIS。
　　 5.pcDNA3.1-hNIS轉染FRO細胞后24h，瞬時攝125Ⅰ能力約為對照組的2.53倍。
　　 6.G418抗性的篩選濃度最終確定為700μg/ml。未轉染組的FRO細胞完全沒有G418抗性。
　　 7.往hNIS-FRO細胞的培養(yǎng)基中引入125Ⅰ后

9、，攝125Ⅰ能力較對照組明顯提高，60min時的125Ⅰ攝取率約為對照組的11.54倍；但當孵育環(huán)境中的125Ⅰ去除后，125Ⅰ則快速外流，30min后hNIS-FRO細胞內的125Ⅰ滯留率僅為初始的9.32％。
　　 8.1μM的17-AAG作用于hNIS-FRO細胞后24h，我們往培養(yǎng)液中加入125Ⅰ，在20～60min的時間段內，藥物作用組的hNIS-FRO細胞攝125Ⅰ能力較對照組有了不同程度的提高；當撤掉環(huán)境中的125

10、Ⅰ后0～30min，藥物作用組的hNIS-FRO細胞內的125Ⅰ滯留率均較對照組明顯增加，125Ⅰ的外流減少，30min后17-AAG作用組的細胞內125Ⅰ滯留率為32.69％，是對照組的3.51倍。
　　 結論：
　　 1.17-AAG可明顯抑制ATC細胞的增殖，且這種抑制作用呈量效及時效依賴性。
　　 2.17-AAG作用后，G0/G1期的ATC細胞明顯增多，細胞凋亡率增加，也呈量效依賴性。證實17-AAG不

11、僅可有效抑制腫瘤細胞增殖，還可誘導細胞凋亡。
　　 3.17-AAG作用后HSP90表達上調，癌蛋白pAkt、Raf-1等表達下調。證實17-AAG的腫瘤細胞增殖抑制作用可能與細胞周期阻滯于G0/G1期以及阻斷腫瘤內的信號通路等有關。
　　 4.將NIS轉染入ATC細胞后可獲得穩(wěn)定表達細胞系，其攝碘能力大大提高，而且這種攝碘能力完全是由NIS基因表達后介導的：此方法尚不能克服腫瘤細胞內攝取的碘迅速外流的缺陷。