WAVE1在上皮性卵巢癌惡性行為中的作用及其機制的初步研究.pdf

1、卵巢惡性腫瘤、子宮頸癌和子宮內膜癌是女性生殖器最常見的三大惡性腫瘤。卵巢惡性上皮性腫瘤占卵巢惡性腫瘤的85～90％。上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）在女性生殖道惡性腫瘤中死亡率最高，全世界每年有近204，000女性診斷患有卵巢癌，近125，000死于該疾病，對婦女生命造成嚴重威脅。卵巢癌起病隱匿、原發(fā)灶隱蔽，患者早期缺少臨床癥狀、不易發(fā)現(xiàn)，3/4的患者初診時通常已經進展到疾病中晚期（FIGOⅢ～

2、Ⅳ期），且腫瘤具有易播散轉移、術后易復發(fā)且易產生化療耐藥等特點。隨著醫(yī)學和科技水平的進步，即使采取了包括臨床腫瘤細胞減滅術和聯(lián)合化療等綜合治療手段，并改進了外科手術方法、增加了新的化療方案，對于最常見的EOC，長期以來，國內、外的資料顯示該疾病患者5年生存率始終停留在30％左右。卵巢癌的侵襲轉移惡性行為是導致卵巢癌治療失敗，死亡的主要原因，因此它的惡性生物學行為及其分子生物學機制一直是腫瘤學研究領域中的熱點。
　　惡性腫瘤的發(fā)生、

3、發(fā)展及轉移是一個復雜的生物學過程，癌細胞先在原位生長，而后向鄰近組織侵襲，使其發(fā)生破壞，然后從原發(fā)灶脫離，侵入血道、淋巴道，進而在遠處形成轉移瘤。在這一過程中，癌細胞向鄰近組織的侵襲生長是腫瘤轉移發(fā)生的起始步驟，而這種對鄰近組織的侵襲性又依賴于癌細胞的定向極化運動能力，即癌細胞偽足往某一方向持續(xù)延伸的動力，這一動力是通過肌動蛋白的聚合所提供。因此探討癌細胞極化運動機制，進而控制肌動蛋白在癌細胞偽足部位的聚合，可以達到早期控制癌細胞侵襲轉

4、移的目的。課題組前期研究采用反向捕獲抗體芯片技術在對“吸煙與粘液性卵巢癌的發(fā)病相關性研究”和在“上皮性卵巢癌早期診斷研究”中發(fā)現(xiàn)，Wiskott-Aldrich綜合征蛋白家族富含脯氨酸同源蛋白1（Wiskott-Aldrich syndromeprotein family verprolin-homologous protein1，WAVE1）是同時存在于兩組研究結果中血清抗體的差異性表達蛋白，可能是EOC細胞的一個標志蛋白。WAVE1

5、基因在1998年發(fā)現(xiàn)并命名，主要負責將細胞信號從酪氨酸激酶受體和Rac傳遞至細胞骨架，從而發(fā)揮其調節(jié)肌動蛋白聚合及細胞骨架重排的作用并最終形成片狀偽足。研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤、前列腺癌、白血病等惡性腫瘤中，WAVE1均高度表達，提示WAVE1在腫瘤的侵襲轉移過程中發(fā)揮著重要作用。但國內外目前尚無WAVE1在EOC惡性行為中的相關研究報道。因此，本課題將分為以下四部分對WAVE1在EOC惡性行為中的作用及其機制進行初步研究。
　　第一部

6、分
　　WAVE1在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義.
　　目的:
　　檢測WAVE1在EOC組織標本中的蛋白表達情況，探討EOC組織中WAVE1的表達與臨床病理特征之間的相關性。
　　方法:
　　(1)采用免疫組織化學法檢測223例EOC組織標本，29例交界性卵巢腫瘤標本，44例良性腫瘤標本和24例正常卵巢組織標本中WAVE1的表達情況，分析WAVE1的異常表達與臨床病理特征之間的關系。
　　(2)采

7、用Western blot法檢測其中44例EOC組織標本，16例交界性卵巢腫瘤標本，32例良性腫瘤標本和22例正常卵巢組織標本中WAVE1的表達情況，并分析WAVE1的異常表達與臨床病理特征之間的關系。
　　(3)采用Kaplan-Meier生存分析比較EOC患者組織中WAVE1表達強弱對生存時間的影響;Cox回歸分析探討有關EOC患者生存時間的影響因素。
　　(4)應用Western blot法檢測EOC細胞株SKOV3，

8、OVCAR-3，ES-2和3AO細胞中WAVE1蛋白表達情況，采用激光共聚焦顯微鏡分析WAVE1在卵巢癌細胞株中的亞細胞定位。
　　結果:
　　(1)免疫組織化學結果顯示，在223例EOC組織中，163例(73.1％)呈WAVE1強陽性表達，60例(26.9％)呈WAVE1低表達或不表達;在交界性卵巢腫瘤、良性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中分別有23例(79.3％)、37例(84.1％)、23例(95.8％)呈WAVE1不表達，差

9、異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在EOC組織中，WAVE1蛋白的表達水平在FIGOⅢ～Ⅳ期組織中顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.001)，中低分化細胞中的表達顯著高于高分化(P＜0.001)，血漿Ca-125≥35 U/ml的EOC患者組織中表達顯著高于Ca-125＜35 U/ml的患者組織(P=0.013)，術后殘余瘤≥1 cm的EOC患者組織中表達顯著高于術后殘余瘤＜1 cm的患者組織(P-0.036)，但與EOC患者年齡、病理類型、腫

10、瘤大小、腹水及病灶單雙側無關(P＞0.05)。
　　(2) Western blot結果顯示，WAVE1在EOC組織中的表達（0.930±0.188）顯著高于交界性卵巢腫瘤（0.586±0.098）、良性卵巢腫瘤(0.542±0.103)和正常卵巢組織（0.441±0.097），差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在EOC組織中，WAVE1蛋白的表達水平與EOC FIGO分期、組織分化、血漿Ca-125及術后殘余瘤有關(P＜0.0

11、5)，而與患者年齡、病理分型、腫瘤大小、腹水、病灶單雙側無關(P＞0.05)，該實驗結果與免疫組織化學結果一致。
　　(3)生存分析顯示WAVE1低表達的EOC患者生存時間顯著長于WAVE1高表達患者(P＜0.05)，多變量分析表明WAVE1高表達、EOC分期中晚期和不理想的腫瘤減滅術分別是EOC預后的獨立因素。
　　(4)WAVE1在EOC細胞株SKOV3，3AO，OVCAR-3和ES-2細胞中均為高表達（分別為1.218

12、±0.112，1.111±0.084，1.057±0.148，和0.968±0.055）;激光共聚焦顯微鏡觀察到WAVE1與肌動蛋白均共表達于卵巢癌細胞的細胞質和細胞膜上。
　　結論:
　　WAVE1在EOC組織和細胞中均呈現(xiàn)高表達。高水平WAVE1與EOC分期、腫瘤分化、血漿Ca-125值和術后殘余瘤有關。WAVE1的高表達與EOC侵襲和不良預后有關，提示WAVE1可能在EOC惡性行為中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分<

13、br>　　WAVE1基因特異性shRNA慢病毒體的構建及穩(wěn)轉染上皮性卵巢癌細胞株的篩選。
　　目的:
　　應用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術設計構建WAVE1的短發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，構建篩選穩(wěn)定轉染卵巢癌細胞株，為后續(xù)研究奠定基礎。
　　方法:
　　(1)設計并化學合成兩對含高效的靶向WAVE1基因的重組質粒和陰性對照。通過雙酶切

14、實驗和DNA測序法對重組質粒進行鑒定。
　　(2)將經測序驗證正確的重組質粒及慢病毒包裝質粒，通過Lipofectamine TM2000共轉染到293T細胞后收集、提純、測定滴度。采用慢病毒載體轉染法轉染至SKOV3細胞中，并建立穩(wěn)定轉染細胞株。
　　(3)采用Western blot法和Real time PCR法分別檢測未轉染組、陰性對照組及轉染組細胞中WAVE1蛋白和mRNA表達量的變化，驗證和篩選WAVE1基因抑制

15、效應顯著的穩(wěn)定轉染細胞株。
　　結果:
　　(1)成功設計并合成兩條WAVE1特異性shRNA，雙酶切實驗和DNA測序報告顯示，基因重組技術成功構建WAVE1基因RNA干擾慢病毒載體，測定滴度為2.2×108U/ml。
　　(2)慢病毒載體介導的WAVE1-shRNA1、WAVE1-shRNA2和陰性對照成功轉染SKOV3細胞，采用嘌呤霉素成功篩選獲得穩(wěn)定表達的單克隆細胞株。
　　(3)通過Western blo

16、t法與Real time PCR法檢測、驗證和篩選，獲得WAVE1基因抑制效果顯著的穩(wěn)定轉染EOC細胞株SKOV3-Ri1細胞。
　　結論:
　　成功靶向構建了WAVE1基因的特異性重組質粒。利用慢病毒載體成功篩選獲得了WAVE1基因抑制效果顯著的卵巢癌穩(wěn)定轉染細胞株，為進一步研究WAVE1惡性生物學行為及其分子機制奠定實驗基礎。
　　第三部分
　　慢病毒介導的WAVE1基因沉默對上皮性卵巢癌細胞惡行為的影響。<

17、br>　　目的:
　　探討WAVE1基因沉默后對SKOV3細胞生長、增殖、粘附和侵襲等惡性生物學行為的影響。
　　方法:
　　(1)采用激光共聚焦顯微鏡觀察WAVE1基因沉默前后SKOV3細胞的形態(tài)學改變。
　　(2) Transwell小室檢測WAVE1基因沉默前后SKOV3細胞的遷移、侵襲能力變化。
　　(3)細胞粘附實驗分析WAVE1基因沉默前后SKOV3細胞的粘附功能改變。
　　(4) MTT

18、比色法測定WAVE1基因沉默前后SKOV3細胞的增殖能力改變。
　　(5)軟瓊脂克隆形成實驗觀察WAVE1基因沉默前后SKOV3細胞的群體依賴性和增殖能力變化。
　　(6)裸鼠皮下移植瘤實驗觀察WAVE1基因沉默前后SKOV3細胞的成瘤能力變化。
　　結果:
　　(1)干擾WAVE1表達能夠使EOC細胞形態(tài)發(fā)生變化:
　　激光共聚焦顯微鏡觀察到，與陰性對照組和正常對照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細胞呈現(xiàn)

19、去極化，絲狀偽足、片狀偽足形成能力顯著減弱，形態(tài)變圓。
　　(2)干擾WAVE1表達能夠抑制EOC細胞侵襲轉移能力:
　　Transwell小室遷移實驗結果顯示，與陰性對照組和正常對照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細胞穿過聚碳酸脂膜的遷移細胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)。
　　Transwell小室侵襲實驗結果顯示，與陰性對照組和正常對照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細胞穿過Matrigel的侵襲細胞數(shù)顯著減少(P＜

20、0.05)。
　　細胞粘附實驗顯示，與陰性對照組和正常對照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細胞的粘附能力顯著降低(P＜0.05)。
　　(3)干擾WAVE1表達能夠抑制EOC細胞生長增殖的惡性程度:
　　MTT法檢測EOC細胞的增殖結果顯示，與陰性對照組和正常對照組相比，在轉染后1d、2d、3d、4d和5d，干擾組SKOV3-Ri1細胞生長曲線較平緩，細胞生長速度明顯減緩(P＜0.05)。
　　軟瓊脂克隆形成實驗

21、顯示，與陰性對照組和正常對照組相比，干擾組SKOV3-Ri1細胞細胞生長速度變慢，克隆形成數(shù)目顯著減少(P＜0.05)。
　　(4)干擾WAVE1表達能夠抑制裸鼠皮下成瘤的惡性行為能力:
　　與陰性對照組相比，干擾組移植瘤成瘤能力顯著減弱，瘤體生長速度緩慢，體積減小。
　　結論:
　　WAVE1基因沉默后改變了卵巢癌細胞SKOV3的形態(tài)變化，顯著抑制了SKOV3細胞的增殖能力和侵襲轉移能力，反向證實了WAVE1在

22、EOC增殖和侵襲轉移惡性行為中的作用，具有作為EOC預防、治療基因靶點的潛在價值。
　　第四部分
　　WAVE1參與上皮性卵巢癌惡性行為的分子機制研究。
　　目的:
　　探討WAVE1參與上皮性卵巢癌增殖和侵襲轉移惡性行為的可能分子機制。
　　方法:
　　(1)采用HE染色觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學變化。
　　(2)采用免疫組織化學法和Western blot法檢測干擾組與陰性對照組移植瘤組織中與

23、增殖、侵襲轉移相關蛋白cyclin D1、VEGF、MMP-2、MMP-9和E-cadherin的水平變化。
　　(3)采用Western blot法檢測WAVE1基因沉默前后卵巢癌細胞中與增殖、侵襲轉移相關信號轉導通路蛋白AKT與p-AKT，p38 MAPK與p-p38 MAPK，ERK1/2與p-ERK1/2蛋白表達水平變化。
　　結果:
　　(1) HE染色后可見，SKOV3-NC組腫瘤細胞失去極性，排列不規(guī)則，

24、而SKOV3-Ri1組細胞可見極性，排列相對整齊。
　　(2)免疫組織化學及Western blot結果均顯示，與SKOV3-NC相比，SKOV3-Ri1移植瘤組織中cyclin D1、VEGF、MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低，而E-cadherin表達水平上升(P＜0.05)。
　　(3) Western blot法檢測信號轉導通路相關的蛋白結果顯示，SKOV3-Ri1細胞中AKT蛋白、p-AKT蛋白及p-p38