抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備、鑒定及其初步應用.pdf

1、1、研究目的與意義
　　本實驗目的是為了制備抗TRPC6多肽單克隆抗體，并在此基礎上建立單抗-單抗夾心ELISA法測定體系。研究的意義在于所建立的ELISA測定體系用于各種組織和細胞中TRPC6蛋白過表達的測定，并可以進一步輔助局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal Segmental Glomerulo Sclerosis，F(xiàn)SGS)的診斷；所制備的單克隆抗體能廣泛應用于免疫標記技術（如金標記、熒光標記、同位素標記等），因此，本研究不

2、論在醫(yī)學研究領域還是臨床診療技術中均有著重要的應用價值。
　　2、研究的主要內容、方法和結果
　　2.1 TRPC6多肽設計與合成
　　瞬時受體電位陽離子通道6(Transient Receptor Potential Channel，TRPC6)是由931個氨基酸組成的六次跨膜結構的通道蛋白。根據多肽設計原則，利用蛋白質軟件分析方法，從5段氨基酸序列中篩選出序列-KDLTKVTLGDNVKYY，該序列為15個氨基酸，

3、為TRPC6分子中的565-579段序列，其在抗原性、親水性、柔韌性及結構分析上均符合設計要求，多肽經合成后純度＞98％，在與鑰孔嘁藍蛋白（KLH）進行偶聯(lián)后，成為制備單克隆抗體的免疫原。
　　2.2抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備與鑒定
　　利用偶聯(lián)后的TRPC6多肽抗原免疫Balb/c小鼠，三次免疫，通過間接ELISA法檢測血清免疫效價，選取免疫效價高的小鼠進行加強免疫。采用聚乙二醇法將免疫小鼠的脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞

4、（P3-X63-Ag8.653）融合，用HAT選擇培養(yǎng)基篩選融合細胞，克隆生長孔用間接 ELISA法檢測上清效價，篩選出陽性克隆，再經過三次有限稀釋法克隆化，初步得到7株陽性率100%的分泌抗體的雜交瘤細胞，命名為A2、D8、E9、G3、G11、H8和F11。在此基礎上經過反復篩選建立雜交瘤細胞系，最終得到分泌抗體穩(wěn)定的三株雜交瘤細胞系，分別為A2、H8和F11，經鑒定A2、H8和F11均為IgG1類，輕鏈類型均為κ型；3株腹水純化后效

5、價分別為A2（1:1600）、H8（1:3200）和F11（1:1600），純化后濃度A2為4.1mg/ml，H8為1.04mg/ml，F(xiàn)11為1.03mg/ml。經SDS-PAGE電泳分析結果，重鏈分子量約55KD，輕鏈分子量約為25KD，Bandscan軟件分析三株純度均大于90%；相對親和力測定結果可見H8和F11相近，均為6μg/ml，A2的相對親和力較低，為12.5μg/ml；單克隆抗體相加實驗結果顯示H8和F11為針對相同的

6、抗原表位，A2與H8、F11均為針對不同抗原表位，通過配對實驗確定A2和F11為最佳配對方案，并進行雙抗體夾心法ELISA體系的構建。
　　2.3雙抗體ELISA法體系的建立及初步應用
　　在確定以A2和F11作為最佳配對的基礎上建立雙抗體夾心ELISA法檢測方法，初步應用于檢測大鼠腦部TRPC6蛋白表達水平。為了確定最佳包被抗體量和酶標抗體量，首先采用cELISA試驗鑒定單抗的敏感性，F(xiàn)11的IC50為0.6μg/ml，A

7、2的IC50為2.8μg/ml，說明F11的靈敏度要高于A2。
　　采用方陣滴定法確定包被A2的最佳濃度為1:200，5μg/ml，HRP-F11的最佳濃度為雙抗體的最佳稀釋濃度為1:150，7μg/ml；采用雙抗體夾心ELISA法建立檢測TRPC6蛋白水平的標準曲線，在0.625μg/ml-10μg/ml范圍內呈線性相關，回歸方程為y=0.0519x+0.1869，相關系數R2=0.992，P<0.05，說明本實驗建立的雙抗體夾

8、心 ELISA法檢測蛋白水平是可靠的，但最佳反應條件還需要進一步優(yōu)化和多樣本的檢測。通過建立的雙抗體夾心 ELISA方法測定大鼠腦蛋白中TRPC6含量，用于組織細胞中TRPC6蛋白過表達的檢測。
　　3、通過以上實驗，可得以下結論
　　3.1通過抗原性、親水性和柔韌性等比較，最終篩選出 KDLTKVTLGDNVKYY作為TRPC6多肽合成序列，合成多肽與KLH偶聯(lián)后可用于免疫動物的免疫原。
　　3.2通過合成肽抗原免疫