副溶血性弧菌電化學免疫傳感器的研制.pdf

1、細菌性食物中毒是影響食品安全的一個非常重要的因素。副溶血性弧菌(VP)是一種嗜鹽性細菌，通常存在于近海海水、海底沉積物、浮游生物、海產品(魚類和貝類)及腌漬食品中，是夏秋季沿海地區(qū)引發(fā)食物中毒的首要病原菌。人多因食入未煮熟的海產品或污染此菌的鹽漬食物而感染，潛伏期為2～26 h，最短僅1 h；主要癥狀為腹痛、腹瀉、嘔吐和發(fā)熱等，糞便為水樣，少數呈血水樣或粘液血便。如果不及時治療，可能會危急生命。 免疫傳感器是由生物學、醫(yī)學、物理

2、、化學和電子學等學科相互滲透所形成的新研究領域，其在食品安全快速檢測、臨床醫(yī)學、環(huán)境監(jiān)測和軍事等領域都有重要應用。憑借其微型化、低成本、特異性強、靈敏度高、檢測快速方便和容易實現在線檢測等優(yōu)點，免疫傳感器已成為當前的研究熱點?？乖?抗體固定化技術是研究和開發(fā)免疫傳感器最為關鍵和重要的工作。 本論文主要圍繞以下幾個方面開展了一些工作： 1.副溶血性弧菌抗原與抗體的制備 本實驗成功制備了副溶血性弧菌抗原與抗體，平板計

3、數得抗原濃度為10<'10> cfu/mL，抗原形態(tài)學表征與文獻報道一致；通過微量滴定凝集法測得抗體效價為128。實驗結果表明，副溶血性弧菌抗原與抗體都具有良好的生物活性和特異性，這為后續(xù)工作的順利開展奠定了基礎。 2.電極預處理與表征 本實驗對玻碳電極和絲網印刷電極進行預處理，通過形態(tài)學表征和電化學表征驗證預處理效果。實驗結果表明，電極預處理達到了預期效果，玻碳電極和絲網印刷電極都具有較好的一致性和重現性，這為后續(xù)實驗

4、的順利開展奠定了基礎。 3.基于殼聚糖金膠和絲網印刷電極的副溶血性弧菌電流型酶免疫傳感器的研制 本實驗將anti-VP摻雜于殼聚糖金膠中，并修飾于絲網印刷電極表面，從而制備一次性副溶血性弧菌免疫傳感器。實驗中采用循環(huán)伏安法和激光掃描共聚焦顯微鏡表征免疫傳感器。采用夾心法檢測VP，免疫傳感器先在待測樣品中室溫孵育30 min，然后在HRP-anti-VP溶液中室溫孵育30 min。采用循環(huán)伏安法監(jiān)測酶促反應，通過免疫反應結

5、合于免疫電極表面的HRP-anti-VP能夠催化硫堇和過氧化氫，利用還原電流的增大來測定樣品中的VP。在優(yōu)化的免疫反應條件及電化學檢測條件下，設定判定標準如下：△i<0.1μA為陰性；△i≥0.1μA為陽性。該免疫電極具有較好的特異性、重現性(RSD<9％)、穩(wěn)定性(一周后電流響應為初始值的87％)和準確性(與EIJSA符合率為95％)。因此，該免疫傳感器可初步用于VP的快速篩檢。 4.基于瓊脂糖/納米金膜和絲網印刷電極的副溶血

6、性弧菌電流型酶免疫傳感器的研制 本實驗將HRP-anti-VP摻雜于瓊脂糖和納米金中，并修飾于絲網印刷電極表面，從而制備一次性副溶血性弧菌免疫傳感器。實驗中采用循環(huán)伏安法和激光掃描共聚焦顯微鏡表征免疫傳感器。采用一步法檢測VP，免疫傳感器在待測樣品中室溫孵育30 min?？乖豢贵w免疫反應生成的免疫復合物部分屏蔽了免疫電極表面HRP的活性中心，從而減弱了HRP對硫堇和過氧化氫的催化能力。采用循環(huán)伏安法監(jiān)測酶促反應，利用還原電流的

7、減小來測定樣品中的VP。在優(yōu)化的免疫反應條件及電化學檢測條件下，設定判定標準如下：△i<0.05μA為陰性；△i≥0.05μA為陽性。該免疫電極具有較好的特異性、重現性(RSD<6％)、穩(wěn)定性(一周后電流響應為初始值的91％)和準確性(與ELISA符合率為97.5％)。因此，該免疫傳感器可初步用于VP的快速篩檢。 5.基于Nation/硫堇/納米金的副溶血性弧菌無試劑電流型免疫傳感器的研制 本實驗采用靜電吸附原理和自組裝

8、技術將Nafion、硫堇、納米金和anti-VP修飾到玻碳電極表面形成敏感膜，從而制備副溶血性弧菌無試劑電流型免疫傳感器。實驗中采用電化學方法表征免疫傳感器的制備過程。無需酶標抗體和復雜操作，根據抗原_抗體特異性結合形成的免疫復合物使得敏感膜有效擴散截面積減小，從而抑制硫堇氧化還原來實現對VP的檢測。在優(yōu)化的免疫反應條件及電化學檢測條件下，設定判定標準如下：△i<0.5μA為陰性；△i≥0.5 μA為陽性。該免疫電極具有較好的特異性、重