基于脫細胞心臟支架的三維心肌組織化模型體外構建、評價及優(yōu)化.pdf

1、目的:冠心病(CHD)是引起心血管疾病(CVD)患者死亡的重要原因之一，心臟移植是終末期心臟病患者的首選治療方法。心臟組織工程目前發(fā)展迅速，其最終目的是體外再造心臟，然而目前尚有許多難題待解決，如支架材料的制備以及種子細胞的選擇。近年來具備天然三維結構的脫細胞支架及體外可誘導分化的骨髓來源間充質干細胞(BMSCs)在心臟組織工程研究領域中應用廣泛。本研究旨在優(yōu)化脫細胞心臟支架的制備方法，體外構建基于脫細胞心臟支架的三維心肌組織化模型，探

2、索脫細胞心臟支架及BMSCs在心臟組織工程中潛在應用價值，以期將其應用于CHD患者的治療及臨床藥理的研究。
　　方法:本研究通過聯合應用十二烷基硫酸鈉(SDS)和聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-x100)對大鼠心臟行逆行主動脈灌流制備脫細胞心臟支架。采用細胞核染色、HE染色、DNA含量檢測以及掃描電鏡(SEM)對制備的脫細胞心臟支架進行評價。通過聯合應用胰蛋白酶及膠原酶分離原代心肌細胞，采用細胞免疫熒光染色的方法對其進行鑒定。通

3、過添加10μM5-氮雜胞苷(5-azacytidine)誘導BMSCs向心肌樣細胞定向分化。同時，分別選取新生大鼠心肌細胞及BMSCs作為種子細胞體外構建三維心肌組織化模型。采用倒置顯微鏡及免疫熒光顯微鏡動態(tài)觀察支架上細胞生長狀態(tài)。結合旋轉生物反應器(RCCS)實現動態(tài)培養(yǎng)，分別采用活-死細胞染色、HE染色、SEM及實時定量PCR檢測對此三維(3D)培養(yǎng)體系進行評價。
　　結果:脫細胞心臟支架大體呈半透明囊狀。HE染色及SEM觀察

4、示支架呈多孔網狀或束狀結構，細胞核染色未見細胞核殘留。進一步行DNA含量檢測示正常心臟組織DNA含量為229.35±0.06ng/mg，而脫細胞心臟支架DNA含量僅為1.64±0.03ng/mg，其含量明顯低于正常心臟組織。新生大鼠心肌細胞在分離培養(yǎng)24h后開始出現自發(fā)搏動，培養(yǎng)至72h細胞連接成片出現同步搏動。細胞免疫熒光染色示分離純化的心肌細胞能夠表達心肌細胞特異性功能蛋白α-actinin以及troponin I。基于新生大鼠心肌

5、細胞構建的三維培養(yǎng)模型經活-死細胞染色及HE染色觀察示三維培養(yǎng)條件下心肌細胞生長狀態(tài)良好，未見明顯死細胞，細胞主要黏附生長于支架表面?；贐MSCs構建的三維培養(yǎng)模型經熒光顯微鏡動態(tài)觀察、HE染色及SEM檢測示細胞沿支架纖維生長，增殖迅速并逐漸形成類組織塊樣結構。RCCS動態(tài)培養(yǎng)條件下細胞更易生長入支架內部。實時定量PCR檢測結果顯示經5-氮雜胞苷誘導后BMSCs轉錄因子Gata4的表達水平顯著提高。將BMSCs與脫細胞心臟支架復合，培