煙草西柏三烯一醇合成酶基因(CYC)的表達(dá)規(guī)律和調(diào)控研究.pdf

1、CYC基因編碼西柏三烯一醇合成酶，是煙草腺毛分泌物合成的關(guān)鍵基因。為明確CYC基因的表達(dá)規(guī)律，本文利用RT-PCR技術(shù)，對(duì)煙草不同類型（達(dá)白1號(hào)、雪茄1號(hào)、Basma、K326）、不同烤煙品種（K326、中煙100、紅花大金元、翠碧1號(hào)、豫煙11號(hào)）和煙草K326不同組織（根、莖、上部葉、中部葉、下部葉、腺毛、去腺毛葉片、花）中的CYC基因的表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。在此基礎(chǔ)上，克隆了CYC基因啟動(dòng)子序列，構(gòu)建了CYC-Pro-GUS inf

2、usion表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草，通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活檢測(cè)，分析了CYC啟動(dòng)子的組織表達(dá)特性及其對(duì)溫度應(yīng)答反應(yīng)模式。另外，對(duì)CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了農(nóng)藝性狀和葉面化學(xué)成分分析，為該基因在煙草抗性及品質(zhì)改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下。
　　1.利用RT-PCR技術(shù)，分析了煙草不同類型、不同烤煙品種、不同組織器官中CYC基因的表達(dá)特性：在不同煙草類型中，香料煙Basma中CYC基因相對(duì)表達(dá)量最

3、高，其次是烤煙K326，雪茄1號(hào)和達(dá)白1號(hào)中較低；在烤煙不同品種中，K326中CYC基因的相對(duì)表達(dá)量顯著最高，其次為“紅大”和“豫煙11號(hào)”，“翠碧1號(hào)”較低，“中煙100”最低；在煙草K326不同組織中，腺毛中CYC基因表達(dá)量顯著高于花、去腺毛葉片、上部葉、中部葉、下部葉、根和莖。說明煙草CYC基因的表達(dá)具有類型、品種及組織特異性。
　　2.煙草CYC基因啟動(dòng)子活性分析：從煙草品種8306DNA中分離出CYC基因啟動(dòng)子，并將啟動(dòng)

4、子插入pC-NPT-GUS載體中，構(gòu)建了表達(dá)載體pC-CYC-Pro-GUS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和葉盤法轉(zhuǎn)化煙草K326，在Kan濃度30mg/ml條件下篩選得到陽性植株，取轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照K326的根、莖和葉片，分別進(jìn)行GUS染液染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片和莖上的腺毛均染上藍(lán)色，而K326沒有。證明CYC基因啟動(dòng)子成功整合至煙草K326的基因組中，并使外源基因GUS在煙草腺毛中特異表達(dá)，說明CYC基因啟動(dòng)子在腺毛中特異表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基

5、因植株分別進(jìn)行4℃和42℃的溫度處理，對(duì)照為28℃條件下的轉(zhuǎn)基因植株，在1小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)時(shí)分別取樣，提取GUS酶蛋白，進(jìn)行GUS酶活檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4℃和42℃處理的轉(zhuǎn)基因煙草的GUS酶活性均小于28℃條件下的活性，表明煙草CYC基因啟動(dòng)子的表達(dá)受溫度調(diào)控。
　　3.CYC基因抑制表達(dá)對(duì)煙草葉面化學(xué)的影響：將10個(gè)CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因株系在可控條件下進(jìn)行田間試驗(yàn)，按照優(yōu)質(zhì)煙草栽培技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。在煙葉成熟期時(shí)采用圓