蟾毒靈抑制人肝癌細胞MHCC97H轉移的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝細胞肝癌占原發(fā)性肝癌的85％-90％，在我國是一種常見的腫瘤類型，其發(fā)病和慢性乙型肝炎密切相關。盡管近年來在預防和治療策略上取得了一定的進展，其死亡率仍然居高不下。由于比較高的手術后肝內及遠處轉移發(fā)生率，肝癌的預后還是比較差。因此，闡明肝癌侵襲及轉移的具體分子機制，變得越來越重要。
　　 肝癌的轉移是一個復雜的生物學過程，每一環(huán)節(jié)都有多種因素的影響和調控，例如細胞外蛋白酶、細胞因子、血管生成因子、生長

2、因子、細胞黏附分子等。其中，Cdc42是Rho家族蛋白，是Ras超家族中相對小分子質量G蛋白的成員之一，有GTP酶活性。研究證實Cdc42是細胞骨架肌動蛋白的重要調節(jié)因子，而肌動蛋白的運動是腫瘤細胞偽足形成及腫瘤轉移的關鍵因素，Cdc42在非活性GDP結合形式和活性GTP結合形式之間循環(huán)，與GDP結合形式游離于胞質中，與GTP結合形式則作用于細胞內的效應因子，與肝癌的轉移密切相關。
　　 蟾毒靈(bufalin)的分子式為C24

3、H34O4，相對分子質量為386.5，是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一，已有研究表明蟾毒靈是一種Na+-K+-ATP酶抑制劑，屬于蟾酥二烯羥酸內酯單體之一，因其分子結構與洋地黃類似，也被歸為強心類固醇類。文獻報道其能夠抑制拓撲異構酶Ⅱ的活性，干擾細胞DNA復制，早期多數(shù)研究集中在誘導人類白血病分化和凋亡方面，近年來有研究表明蟾毒靈可以抑制子宮內膜異位細胞以及卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞的生長。
　　 在本研究中，我們利

4、用高轉移潛能的肝癌細胞系，通過體外及體內實驗，來探索蟾毒靈對肝癌轉移的抑制作用和Cdc42蛋白之間的相關性。發(fā)現(xiàn)Cdc42是蟾毒靈作用的靶點之一，在肝癌細胞運動和轉移中起關鍵作用，蟾毒靈可能是通過下調Cdc42來抑制肝癌轉移。
　　 研究目的：
　　 本研究觀察蟾毒靈對肝癌侵襲轉移的影響，在此基礎上進一步通過體外、體內實驗明確其抗肝癌細胞侵襲轉移的具體機制，明確蟾毒靈抑制侵襲轉移作用和Cdc42信號通路之間的關系，為尋找

5、有效的抗肝癌轉移藥物和治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 (1)不同濃度蟾毒靈抑制肝癌細胞運動的效應
　　 以不同濃度(50-400nmol/L)的蟾毒靈干預MHCC97H細胞，采用劃痕實驗定性研究蟾毒靈對肝癌細胞遷移的影響；在此基礎之上，利用Transwell小室，包被基質膠，體外模擬基底膜，進行侵襲和遷移實驗，定量觀察蟾毒靈對肝癌細胞侵襲、遷移的影響。
　　 (2)蟾毒靈對肝癌轉移相關信號

6、通路及Cdc42蛋白的影響
　　 首先，觀察不同肝癌細胞系中Cdc42的表達情況，westernblot檢測蟾毒靈對Cdc42蛋白表達的影響，構建Cdc42siRNA，觀察Cdc42基因RNA干擾后對肝癌細胞侵襲能力的影響；觀察蟾毒靈對MAPK信號通路的影響，分別使用ERK、JNK、P38抑制劑后觀察蟾毒靈對肝癌細胞侵襲轉移的影響；westernblot檢測蟾毒靈對P53基因表達及下游靶分子Bax、P27的影響；分別提取胞漿胞核

7、蛋白，觀察NF-κBp65蛋白入核的變化；westernblot檢測蟾毒靈對COX-2蛋白表達的影響；ELISA方法檢測MMPs家族MMP-2、MMP-3、MMP-9水平變化。
　　 (3)蟾毒靈體內抑制MHCC97H肝癌細胞轉移的實驗研究
　　 原位植入建立裸鼠人肝癌轉移模型LCI-D20,蟾毒靈干預后(低劑量組：0.25mg·kg-1d-1；高劑量組：0.5mg·kg-1d-1)，通過評價原位瘤的體積、重量來評價蟾毒

8、靈的抑瘤作用，通過對裸鼠體重的評價來研究蟾毒靈對裸鼠肝癌轉移模型惡病質的影響；肝臟原位移植瘤塊，常規(guī)石蠟包埋病理切片并用免疫組織化學法觀察肝原位移植瘤中Cdc42蛋白的表達情況；肺臟標本經(jīng)10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、HE染色，于不同平面切片20～30張，以觀察肺轉移情況。
　　 結果：
　　 (1)蟾毒靈抑制肝癌細胞運動實驗研究
　　 劃痕實驗結果顯示，蟾毒靈干預組劃痕損傷區(qū)發(fā)生遷移的細胞數(shù)目少于空白

9、對照組，提示蟾毒靈具有抑制MHCC97H細胞遷移的趨勢，Transwell小室侵襲及遷移實驗結果顯示蟾毒靈干預組穿膜細胞數(shù)明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，50nmol/L蟾毒靈即能有效抑制肝癌細胞侵襲和遷移。
　　 (2)蟾毒靈對Cdc42蛋白及肝癌轉移相關信號通路的影響
　　 Westernblot結果顯示Cdc42蛋白在MHCC97H細胞中高表達，蟾毒靈(200nmol/L)處理后2h內Cdc42蛋

10、白表達明顯下調，Cdc42siRNA干擾后，能夠增強蟾毒靈抑制肝癌細胞MHCC97H侵襲的作用，和蟾毒靈發(fā)揮協(xié)同的作用；蟾毒靈對MAPK家族的影響包括抑制ERK信號通路，活化JNK、P38信號通路，ERK通路抑制劑(PD98059)，能夠增強蟾毒靈抑制肝癌細胞MHCC97H侵襲的作用，而JNK抑制劑(SP-600125)、P38抑制劑(SB203580)能夠部分逆轉蟾毒靈抑制肝癌細胞MHCC97H侵襲的作用；蟾毒靈能夠使P53基因及下游

11、靶分子Bax、P27表達上調；蟾毒靈能夠抑制NF-κBp65蛋白入核；蟾毒靈能夠抑制COX-2蛋白表達；ELISA結果顯示蟾毒靈能夠減少MMP-2的分泌，而對MMP-3、MMP-9的分泌未見明顯影響；
　　 (3)蟾毒靈體內抑制MHCC97H肝癌細胞轉移的實驗研究
　　 與對照組比較，蟾毒靈干預組裸鼠外觀上消瘦較對照組有所改善，精神狀態(tài)、活動能力也較對照組好；蟾毒靈干預的裸鼠腫瘤重量、體積明顯減小，與DMSO對照組相比，

12、差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，提示了蟾毒靈對原位移植肝細胞癌腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。蟾毒靈處理組瘤塊切面多呈黃白色豆渣樣，病理證實為較多壞死：蟾毒靈處理組肺轉移率明顯低于對照組(P<0.05)；Cdc42在蟾毒靈處理組中的陽性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示在體內Cdc42和肝細胞癌轉移相關，并可被蟾毒靈抑制。
　　 結論：
　　 1.蟾毒靈可抑制高轉移潛能的肝癌細胞(MHCC97H)侵襲、

13、遷移運動。
　　 2.蟾毒靈可以抑制Cdc42表達，其抑制高轉移潛能的肝癌細胞侵襲、遷移運動和抑制Cdc42密切相關。
　　 3.蟾毒靈可能通過活化JNK、P38MAPK，抑制ERK通路發(fā)揮抑制MHCC97H細胞侵襲轉移的作用。
　　 4.蟾毒靈能夠上調P53及其下游靶分子Bax和P27表達。
　　 5.蟾毒靈能抑制MMP-2、COX-2表達，而對MMP-3、MMP-9表達未見明顯影響，提示我們蟾毒靈抑制