重組人IL-31的原核表達、純化及其皮膚炎癥相關性研究.pdf

1、目的:探索人IL-31在原核細胞中的表達、純化和復性的方法，研究人IL-31與皮膚炎癥的相關性。 方法:(1)將含有表達質粒pET-32a/rhlL-31和pET-28a/rhlL-31的重組菌Ecli.BL21(DE3)分別37℃培養(yǎng)，用IPTG誘導表達，用SDS-PAGE初步觀察重組蛋白rhlL-31的表達量并對其進行初步分析。對兩種表達菌株分別進行連續(xù)傳代，比較其穩(wěn)定性和蛋白表達效率，選擇較穩(wěn)定、表達效率較高的菌株作為后續(xù)

2、研究的工程菌。(2)將目的蛋白條帶送檢進行氨基酸序列分析。(3)破碎菌體，洗去雜蛋白，溶解包涵體，過Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱純化。(4)對純化產物進行透析復性。(5)Brad-Ford法測蛋白濃度，SDS-PAGE和薄層掃描分析純化產物中目的蛋白的純度和含量。(6)用獲得的復性后rhIL-31蛋白以不同的劑量對BALB/C小鼠進行分組皮內注射，觀察其皮膚和行為變化，7天后取注射部位皮膚作石蠟切片并進行HE染色，觀察皮膚組織的炎性細胞

3、浸潤情況；同時作小鼠外周血常規(guī)檢測，觀察其外周血的細胞學變化；眼球采血收集血清，檢測IL-4，IL-10，IFN-γ水平，分析其外周血Th1/Th2細胞的平衡變化。(7)無菌分離人外周血淋巴細胞，采用MTT法檢測不同濃度rhIL-31對人淋巴細胞增殖的影響。 結果:(1)pET-32aJrhIL-31和pET-28a/rhIL-31在E.coli.BL21(DE3)中均獲得表達，反復多次試驗證實，前者能較穩(wěn)定而高效地表達rhIL

4、.31。(2)氨基酸序列分析證實，我們獲得的重組蛋白與人IL-31氨基酸序列一致。(3)pET-32a/rhIL-31在E.coli.BL21(DE3)中37℃誘導過夜時表達效率達到最高，為29％，可溶性包涵體中rhlL-31的純度為34％，含量占rhIL-31總量的19.9％，經Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱純化，獲得純度為83％的目的蛋白產物，rhIL-31含量占rhIL-31總量的16.5％，過柱后蛋白平均得率為32.4％。(4)復

5、性后重組蛋白有生物學活性，能夠刺激BALB/C小鼠皮膚炎癥反應，出現撓抓、脫毛、躁狂等現象，皮膚病理切片顯示處理組注射部位表皮增厚，角質層肥厚，真皮及皮下均有不同程度的炎性細胞浸潤，以中性粒細胞和淋巴細胞為主，并在一定范圍內呈劑量效應依賴關系。(5)小鼠外周血常規(guī)顯示，受試各組外周血中性粒細胞和嗜酸性粒細胞比例均較對照組高，并在一定范圍內呈劑量效應依賴關系。(6)小鼠血清學檢測提示，進行皮內rhIL-31注射的組別，其IL-4、IL-1

6、0、OL-4/IFN-γ)平均水平均較正常對照組有所升高，具有統(tǒng)計學意義。(7)MTT實驗提示，rhIL-31對人外周血淋巴細胞增殖情況有一定的抑制作用。 結論:(1)Ecoli.BL21(DE3)中pET-32a/rhIL-31的表達效率較pET-28a/rhIL-31高且穩(wěn)定，表達效率在37℃過夜時最高，占菌體蛋白總量的29％，可溶性包涵體中rhIL-31的純度為34％，含量占rhIL-31總量的19.9％，經Ni-NTA瓊

7、脂糖凝膠FF柱純化，獲得純度為83％的目的蛋白產物，rhIL-31含量占rhIL-31總量的16.5％，過柱后蛋白得率平均為32.4％。(2)rhIL-31可刺激BALB/C小鼠出現脫毛和皮膚炎癥，能導致小鼠Th1、Th2相關細胞因子水平的改變，使其向Th2型細胞應答偏移，這與人類特應性皮炎的病理以及血清學改變相似，暗示IL-31可能與特應性皮炎等皮膚炎癥的發(fā)病機制有關，在Th1、Th2細胞應答的平衡中發(fā)揮一定作用。(3)本研究為rhI