食管鱗癌組織中RhoC基因的表達及其與浸潤轉移關系的研究.pdf

1、食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,其死亡率居世界惡性腫瘤的第六位,而食管癌的浸潤轉移又是引起食管癌患者死亡的主要因為,因此深入研究食管癌浸潤轉移的機制并探索有效的抗轉移治療措施是目前食管癌診治中的重點和難點,對食管癌的防治具有重大意義。
　　 Rho(Rashomologue)家族成員(RhoA、RhoB和RhoC)是一類與Ras同源的三磷酸鳥苷(Guanosinc triohosphte,GTP)結合蛋白,研究表明,RhoC基

2、因的高表達與腫瘤的浸潤轉移及血管生成密切相關。近年來,先后有文獻報道,RhoC高表達或活性升高與乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、結腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌和胃癌等多種腫瘤的侵襲轉移密切相關。有關RhoC在食管鱗癌中的表達及其與浸潤、轉移的關系,迄今國內外尚無系統(tǒng)性研究報道。
　　 為深入探討RhoC基因與食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉移的關系,尋找抑制食管鱗癌發(fā)生和浸潤轉移的有效方法,本研究首先采用RT-PCR、原位雜交及免疫組化SP法聯(lián)合檢

3、測了食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜組織中RhoC mRNA和蛋白的表達水平；采用免疫組化SP法檢測了食管鱗癌、癌旁不典型增生及正常食管粘膜組織中血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達情況,同時用CD105抗體檢測食管鱗癌組織中微血管密度(Mi-crovascularDensity,MVD),探討了RhoC表達與VEGF、MVD的相關性。在此基礎上,成功構建了pRN

4、AT-U6.1-siRhoC干擾表達載體,并將其穩(wěn)定轉染至食管癌EC9706細胞中,以建立RhoC基因“敲弱”(knockdown)的細胞模型,運用boyden chamber侵襲實驗觀察轉染后細胞體外侵襲力的改變；采用Westernblot、RT-PCR、免疫細胞化學及原位雜交等實驗方法檢測了轉染前后RhoC蛋白及mRNA的表達變化；同時采用免疫組化法檢測了干擾RhoC的表達對VEGF的影響。最后通過裸鼠移植瘤實驗,采用原位雜交、RT

5、-PCR及免疫組織化學方法檢測裸鼠移植瘤組織中RhoC基因的表達,并采用免疫組織化學方法檢測移植瘤組織中VEGF的表達,從體內角度觀察RhoC基因對裸鼠移植瘤的作用及其對VEGF表達的影響,試圖闡明RhoC的表達在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉移中的意義；并進一步闡明食管鱗癌中RhoC基因與血管生成之間的關系,以期為食管癌的靶向治療提供理論依據。本研究共分以下3個部分。
　　 第-部分RhoC、VGGF及CD105在食管鱗癌組織中

6、的表達及其意義
　　 方法：
　　 1.采用RT-PCR、原位雜交、免疫組織化學等技術分別檢測RhoC基因在62例食管鱗癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管粘膜組織的表達情況。
　　 2.采用免疫組化SP法檢測血管內皮細胞生長因子(VEGF)在62例食管鱗癌、31例癌旁不典型增生及62例正常食管粘膜組織中的表達情況,同時用CD105抗體檢測食管鱗癌中的微血管密度(MVD)。
　　 3.統(tǒng)計學處理:應用

7、SPSS13.0軟件處理,采用x2檢驗、t檢驗和方差分析,并利用Spearman進行相關性分析。檢驗水準it=0.05。
　　 結果：
　　 1.RhoC mRNA及蛋白陽性表達主要定位于食管癌細胞的胞質內,在正常食管粘膜組織內無表達或者表達量較弱。
　　 2.RT-PCR、原位雜交及免疫組化聯(lián)合檢測RhoC結果顯示:在正常食管粘膜、癌旁不典型增生和食管鱗癌組織中,RhoC mRNA表達水平依次升高,三者組間比較

8、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其蛋白的陽性表達率亦依次升高,三者組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.在深層浸潤組和有淋巴結轉移組的食管鱗癌組織中,RhoC mRNA、蛋白的表達顯著高于淺層浸潤組和無淋巴結轉移組,組間比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4.在Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級食管鱗癌組織中RhoC mRNA、蛋白表達的結果顯示,分化程度越低,其陽性表達越高,組間比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0

9、5)
　　 5.RhoC mRNA、蛋白的表達與食管癌患者的性別、年齡無關(P>0.05)。
　　 第二部分pRNAT-U6.1-si RhoC干擾表達載體的構建及其對人食管癌細胞株EC9706細胞生物學行為的影響
　　 方法：
　　 1.設計三對RhoC基因的反義寡核苷酸片段和一對無義序列,經過退火及酶切后,克隆入RNA干擾表達載體pRNAT-U6.1,體外擴增純化后,得到重組構建的pRNAT-U6.1

10、-siRhoC干擾表達載體。
　　 2.通過脂質體2000介導將pRNAT-U6.1-siRhoC干擾表達載體轉染食管鱗癌EC9706細胞,利用G418篩選穩(wěn)定表達株。
　　 3.采用PCR、Western-blot、原位雜交、免疫細胞化學等技術,檢測轉染pRNAT-U6.1-siRhoC1的EC9706細胞內RhoC表達水平的變化。
　　 4.采用免疫細胞化學技術,檢測轉染pRNAT-U6.1-siRhoC1的

11、EC9706細胞內VEGF表達水平的變化。
　　 5.應用Boyden Chamber細胞體外遷徙力實驗檢測轉染pRNAT-U6.1-siRhoC1 EC9706細胞侵襲特性的變化。
　　 6.統(tǒng)計學處理:應用SPSS11.0軟件處理,采用x2檢驗、t檢驗和方差分析。檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 1.PCR鑒定結果表明成功構建了三個siRNA表達載體pRNAT-U6.1-siRhoC1,pR

12、NAT-U6.1-siRhoC2和pRNAT-U6.1-siRhoC3,并篩選出抑制效果最佳的siRNA表達載體pRNAT-U6.1-siRhoC1。
　　 2.在轉染pRNAT-U6.1-siRhoC1組EC9706細胞內RhoC表達水平顯著低于無關siRNA對照組(轉染pRNAT-U6.1-siC)及未轉染組(P<0.05)。
　　 3.在轉染pRNAT-U6.1-siRhoC1組的EC9706細胞內VEGF表達水平

13、顯著低于無關siRNA對照組(轉染pRNAT-U6.1-siC)及未轉染組(P<0.05)。
　　 4.Boyden chamber體外侵襲實驗結果顯示:pRNAT-U6.1-siRhoC1轉染組EC9706細胞穿越Matrigel膠的細胞數顯著減少(P<0.05),而無關siRNA對照組(轉染pRNAT-U6.1-siC)及未轉染組EC9706穿越Matrigel膠的細胞數無明顯差異(P>0.05)。
　　 第三部分p

14、RNAT-U6.1-si RhoC干擾表達載體對裸鼠移植瘤生長的影響
　　 方法：
　　 1.分別將pRNAT-U6.1-siRhoC1轉染組、無關siRNA對照組及未轉染組的食管癌細胞株EC9706注入裸鼠皮下,比較各組裸鼠的成瘤情況及腫瘤大小。
　　 2.分別應用RT-PCR、原位雜交、免疫組織化學方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中RhoC基因的表達情況。
　　 3.應用免疫組織化學方法檢測各組裸鼠移植瘤組

15、織中VEGF基因的蛋白表達情況。
　　 4.統(tǒng)計學處理:應用SPSS13.0軟件處理,采用x2檢驗、t檢驗和方差分析。檢驗水準α=0.05。
　　 結果：
　　 1.在無關siRNA對照組及未轉染組中,其裸鼠移植瘤的體積顯著大于pRNAT-U6.1-siRhoC1轉染組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 2.在無關siRNA對照組及未轉染組裸鼠移植瘤組織內,RhoC蛋白及mRNA的表達均

16、顯著高于pRNAT-U6.1-siRhoC1轉染組的表達,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3.在無關siRNA對照組及未轉染組裸鼠移植瘤組織內,VEGF的蛋白表達顯著高于pRNAT-U6.1-siRhoC1轉染組的表達,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1.食管鱗癌組織中RhoC蛋白及mRNA均呈明顯的高表達,且與食管鱗癌的浸潤轉移及組織學分級密切相關,提示Rho

17、C可能是食管鱗癌侵襲、轉移的重要生物學標記。
　　 2.食管鱗癌組織中,RhoC的高表達可上調VEGF的表達,進而促進腫瘤血管的生成。
　　 3.成功構建了pRNAT-U6.1-siRhoC1干擾載體,并將其導入食管鱗癌細胞株EC9706細胞中,成功建立了RhoC基因沉默的細胞株,為進一步研究RhoC的生物學功能和RhoC的靶向治療奠定了基礎。
　　 4.體外實驗顯示,pRNAT-U6.1-siRhoC1可降低E