腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）基因克隆及其基因工程細胞對體外培養(yǎng)腦片生長的影響.pdf

1、目的：帕金森氏病(PD)是神經系統錐體外系常見的慢性退行性疾病。主要病理變化是位于中腦黑質的多巴胺(DA)能神經元變性和消失，導致紋狀體的DA能神經纖維終末變性消失，這種黑質-紋狀體神經傳導路的損害使得DA水平下降，由此產生了PD的典型癥狀。目前，臨床上對PD治療的研究主要集中在兩個方面：一是以補充多巴胺的不足為目的藥物治療：如給病人定期服用左旋多巴，美多巴，息寧，安坦等，通過藥物治療病人的大多數臨床癥狀改善，但并不能阻止病情的發(fā)展，即

2、不能治愈。另一種方法是以搶救幸存神經元為目的的治療：如導入神經營養(yǎng)因子的基因治療。 腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)作為神經生長因子家族成員，與神經系統發(fā)育有著密切關系，不僅對中樞神經元的發(fā)育、增殖分化、存活起重要作用，而且對損傷后神經元的修復與功能重塑也起了重要作用。近年來神經生長因子家族一些成員紛紛被克隆并應用于中樞神經系統退行性疾病的防治。 針對上述研究

3、趨勢，本研究采用腦皮質-紋狀體-黑質三組織聯合培養(yǎng)技術，選用腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)通過RT-PCR及載體克隆的方法，構建BDNF真核表達載體pEGFP-N1-BDNF，以重組質粒pEGFP-N1-BDNF作為外源性基因，與脂質體一起轉染骨髓基質干細胞(BMSCs)，通過熒光顯微鏡觀察，并結合BDNF免疫細胞化學染色等形態(tài)學方法鑒定穩(wěn)定表達BDNF蛋白的基因工程細胞，檢測其對體外聯合培養(yǎng)腦片生長的影響。 材料與方法：(一)

4、大鼠骨髓基質干細胞(BMSCs)體外培養(yǎng)及向神經元誘導分化研·1·究1.骨髓基質干細胞的采集與貼壁法培養(yǎng)。 2.反復傳代，使BMSCs得到擴增和純化，獲得高純度的BMSCs。 3.骨髓基質干細胞的鑒定：應用免疫細胞化學方法鑒定培養(yǎng)細胞的表面標記：CD34、CD71。 4.誘導液的制備：收集腦片培養(yǎng)液。 5.骨髓基質干細胞向神經元誘導分化及鑒定：Nissel染色、NSE和GFAP及TrkB免疫細胞化學染色。

5、 (二)BDNF熒光真核表達載體的構建及在骨髓基質干細胞中的表達1.大鼠胚胎腦組織總RNA提取。 2.RT-PCR擴增BDNF基因片段。 3.測序載體PMD-18-T-BDNF構建、鑒定。 4.真核表達載體pEGFP-N1-BDNF構建、鑒定、測序。 5.轉染到從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)的BMSCs中。 6.轉染細胞的觀察及BDNF免疫細胞化學染色鑒定。 (三)轉染BDNF基因的骨髓基質

6、干細胞對中腦黑質-紋狀體腦片生長的影響 1.大腦皮質-中腦黑質-紋狀體腦片培養(yǎng)。 2.熒光顯微鏡下神經元存活率的檢測。 3.TH免疫組織化學染色。 4.黑質腦片的TH陽性神經細胞和紋狀體中TH陽性神經纖維密度及含量測定。 結果：(一)大鼠骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)及向神經元誘導分化研究L分離的圓形骨髓單個核細胞于12h貼壁生長；培養(yǎng)15天的細胞作活體甲苯胺蘭染色，可見細胞長成漩渦狀。2.對培養(yǎng)第6代的

7、細胞作免疫細胞化學鑒定，結果CD71呈現棕色，即為陽性，CD34呈現陰性。這證明培養(yǎng)的細胞是骨髓基質干細胞中的亞群。3.經過用腦片培養(yǎng)液誘導后，細長形細胞中有Nissel染色反應產物。4.誘導后的60％細胞表達神經元特異性烯醇化酶(NSE)及酪氨酸激2酶受體B(TrkB)，未見神經膠質酸性蛋白(GFAP)的表達。 (二)BDNF熒光真核表達載體的構建及在骨髓基質干細胞中的表達1.質粒轉染BMSCs18h后，在倒置熒光顯微鏡下，p

8、EGFP-N1-BDNF和pEGFP-N1空載體組鏡下可見細胞發(fā)出綠色熒光，未經轉染的細胞未見熒光。GFP呈陽性的BMSCs細胞數約為60％。 2.通過BDNF蛋白的免疫熒光細胞化學染色方法，鑒定經轉染的BMSCs細胞呈綠色熒光反應，陽性的BMSCs細胞數約為50％，提示BDNF在細胞中表達，未經轉染的BMSCs成陰性反應。 (三)轉染BDNF基因的骨髓基質干細胞對中腦黑質-紋狀體腦片生長的影響1.實驗組較對照組的腦片長

9、勢更旺盛，生長暈較寬。中腦黑質中有長的突起長入紋狀體內，且有很強的趨化性。大腦皮質的神經細胞也向周圍伸出突起，但無明顯的方向感。 2.經過TH免疫組織染色，證明由中腦黑質長人紋狀體中的神經纖維為TH陽性。實驗組Ⅱ和實驗組Ⅰ中的紋狀體中TH陽性神經纖維密度在第20d和30d時，顯著高于對照組(p＜0.05)，實驗組Ⅱ在30d時極顯著高于對照組(p＜0.01)。實驗組Ⅱ與實驗組Ⅰ差異不顯著。 3.10d、20d和30d時，培

10、養(yǎng)腦片溴化乙啶染色結果為，實驗組未發(fā)現熒光。對照組在20d時，約有10％的細胞死亡，在30d時培養(yǎng)的腦片中大面積的細胞呈現熒光反應即為死細胞。 結論：1.骨髓基質干細胞能在腦片培養(yǎng)液的誘導下轉化為神經元并表達神經元的特異性標記蛋白酶-NSE及細胞中有尼氏體出現，培養(yǎng)液中的神經營養(yǎng)因子家族激活TrkB信號傳導通路可能是BMSCs定向誘導分化的機制之一。 2.本實驗通過基因重組的方法將BDNF基因克隆到質粒pEGFP-N1上

11、，采用菌落PCR、限制性內切酶酶切和DNA序列分析的方法鑒定BDNF熒光真核表達載體的成功構建；采用脂質體介導的基因轉移技術將pEGFP-N1-BDNF轉入BMSCs，通過免疫細胞化學方法檢測到轉染后的BMSCs中有BDNF蛋白的表達，獲得了可分泌神經營養(yǎng)因子又有熒光生物學標記·3·物特征的工程型細胞材料。 3.Milliercell膜上大腦、紋狀體及黑質聯合腦片培養(yǎng)是一種簡便有效的神經組織體外培養(yǎng)方法，可用于制作帕金森病等的組