補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷及增強(qiáng)腦缺血耐受的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)陽還五湯(BuyanghuanwuTang，BYHWT)具有抗腦缺血損傷作用，并從抗氧化應(yīng)激和調(diào)控凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)等角度探討其作用機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，建立小鼠腦缺血耐受(brainischemictolerance，BIT)模型，觀察BYHWT干預(yù)腦預(yù)缺血(cerebralischemicpreconditioning，CIP)誘導(dǎo)BIT形成的情況，以期證實(shí)BYHWT具有增強(qiáng)CIP腦保護(hù)效果，促進(jìn)腦缺血耐受形成的

2、作用，并初步探討其作用機(jī)制，進(jìn)一步為臨床使用BYHWT預(yù)防和治療腦缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法第一部分補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷的作用和機(jī)制研究將48只健康昆明小鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、缺血損傷組和中藥預(yù)防組，每組n=16。中藥預(yù)防組灌服補(bǔ)陽還五湯煎劑，每次10ml/kg(體重)，2次/日，連續(xù)7d；假手術(shù)組和缺血損傷組灌服等量生理鹽水。7d后缺血損傷組和中藥預(yù)防組均用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈20min，然后恢復(fù)灌流；假手術(shù)組只

3、暴露雙側(cè)頸總動脈20min，但不阻斷血流。術(shù)后24h從各組隨機(jī)選取8只小鼠斷頭處死，迅速剝?nèi)∪X，左側(cè)半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織SOD活性和MDA含量；右側(cè)半球用4％多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化方法檢測海馬組織Bax和bcl-2蛋白表達(dá)。其余小鼠于術(shù)后7d全部處死，迅速剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度(neuronald

4、ensity，ND)，免疫組化檢測Bax和bcl-2蛋白同上。 第二部分補(bǔ)陽還五湯增強(qiáng)腦缺血耐受的作用和機(jī)制研究將64只健康昆明小鼠隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組、缺血損傷組、BIT模型組和中藥干預(yù)組，每組n=16。中藥干預(yù)組灌服補(bǔ)陽還五湯煎劑，每次10ml/kg(體重)，2次/日，連續(xù)7d；假手術(shù)組、缺血損傷組和BIT模型組灌服等量生理鹽水。灌藥第5天中藥干預(yù)組和BIT模型組均用微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈6min作為預(yù)處理，然后恢復(fù)灌流

5、；假手術(shù)組和缺血損傷組只暴露雙側(cè)頸總動脈6min，但不阻斷血流。灌藥第7天缺血損傷組、中藥干預(yù)組和BIT模型組均阻斷雙側(cè)頸總動脈血流20min，然后恢復(fù)灌流；假手術(shù)組只暴露頸總動脈20min，但不阻斷血流。末次手術(shù)后24h從各組隨機(jī)選取8只小鼠斷頭處死，迅速剝?nèi)∪X，左側(cè)半球低溫保存，采用生化方法檢測腦組織SOD活性和MDA含量。其余小鼠于末次手術(shù)后7d全部處死，迅速剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1至4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，

6、HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級和神經(jīng)元密度(ND)，免疫組化檢測Bax和bcl-2蛋白同上。 結(jié)果第一部分補(bǔ)陽還五湯抗腦缺血損傷的作用和機(jī)制研究1.術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，組織學(xué)分級多為0級和1級。缺血損傷組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷明顯，主要表現(xiàn)為錐體細(xì)胞缺失較多，殘留的錐體細(xì)胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)錐體細(xì)胞胞核固縮，組織學(xué)分級多為2級和3級，與假手術(shù)組相比有

7、顯著性差異(P＜0.05)。中藥預(yù)防組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷輕微，組織學(xué)分級多為1級和0級，與假手術(shù)組相比無顯著性差異(P＞0.05)，而與缺血損傷組相比差異顯著(P＜0.05)。 通過計(jì)算海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度得知，假手術(shù)組(ND=212±27n/mm)和中藥預(yù)防組(ND=184±32n/mm)神經(jīng)元密度均明顯高于缺血損傷組(ND=73±36n/mm，P＜0.01)，而假手術(shù)組和中藥預(yù)防組無明顯差異(P＞0.05)。2.術(shù)后2

8、4h腦組織SOD活性和MDA含量變化 缺血損傷組小鼠腦組織SOD活性(175.82±36.97U/ml)與假手術(shù)組(372.78±29.82U/ml)相比明顯下降(P＜0.01)，而MDA含量(9.60±0.63nmol/ml)與假手術(shù)組(5.43±0.38nmol/ml)相比明顯升高(P＜0.01)。與缺血損傷組相比，中藥預(yù)防組SOD活性(352.16±28.35U/ml)明顯升高(P＜0.01)，而MDA含量(6.01±0.

9、40nmol/ml)明顯下降(P＜0.01)。 3.術(shù)后24h、7d海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達(dá)變化假手術(shù)組Bax可見微弱表達(dá)(24h：11.49±1.83。7d：11.59±1.93。單位：陽性細(xì)胞數(shù)/視野，下同)，bcl-2未見明顯表達(dá)(24h：5.12±1.37。7d：6.17±1.34)。與假手術(shù)組相比，缺血損傷組Bax表達(dá)(24h：48.70±3.52。7d：48.96±3.42)明顯增多(P＜0.01)，b

10、cl-2表達(dá)亦見增多(24h：6.26±1.46。7d：6.77±1.22)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與缺血損傷組相比，中藥預(yù)防組Bax表達(dá)(24h：17.73±2.37。7d：18.52±2.50)明顯減少(P＜0.01)，bcl-2表達(dá)(24h：25.96±1.57。7d：27.23±1.41)明顯增多(P＜0.01)。 第二部分補(bǔ)陽還五湯增強(qiáng)腦缺血耐受的作用和機(jī)制研究1.術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變假手術(shù)組海

11、馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，組織學(xué)分級多為0級和1級，神經(jīng)元密度ND=214±28n/mm；缺血損傷組海馬CA1區(qū)損傷明顯，組織學(xué)分級多為2級和3級，神經(jīng)元密度ND=76±26n/mm，兩組相比有顯著性差異(P＜0.01)。BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(多為1級和2級)明顯低于缺血損傷組(P＜0.05)，而神經(jīng)元密度(ND=153±31n/mm)明顯高于缺血損傷組(P＜0.05)又明顯低于假手術(shù)組(P＜0.05)。中藥干預(yù)組海馬C

12、A1區(qū)組織學(xué)分級(多為1級和0級)明顯低于缺血損傷組(P＜0.01)和BIT模型組(P＜0.05)，神經(jīng)元密度(ND=196±23n/mm)明顯高于缺血損傷組(P＜0.01)和BIT模型組(P＜0.05)。2.術(shù)后24h腦組織SOD活性和MDA含量變化與假手術(shù)組(SOD：302.34±26.31U/ml；MDA：6.85±0.37nmol/ml)相比，缺血損傷組SOD活性(175.82±36.72U/ml)明顯下降，而MDA含量(9.8

13、3±0.72nmol/ml)明顯升高(P＜0.01)。與缺血損傷組相比，BIT模型組SOD活性(243.25±28.80U/ml)明顯升高，而MDA含量(7.78±0.36U/ml)明顯下降(P＜0.05)。與BIT組相比，中藥干預(yù)組SOD活性(286.16±28.34U/ml)明顯升高，而MDA含量(6.23±0.40U/ml)明顯下降(P＜0.05)。 3.術(shù)后7d海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達(dá)變化與假手術(shù)組(Bax

14、：12.35±2.23。bcl-2：5.17±1.34)相比，缺血損傷組Bax(53.96±1.42)表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，而bcl-2表達(dá)(5.77±1.22)雖有增多趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與缺血損傷組相比，BIT模型組Bax表達(dá)(22.59±1.83)明顯減少(P＜0.01)，而bcl-2表達(dá)(21.14±1.21)明顯增多(P＜0.01)。與BIT模型組相比，中藥干預(yù)組Bax表達(dá)(15.82±1.40)明顯

15、減少(P＜0.05)，bcl-2表達(dá)(28.43±1.43)明顯增多(P＜0.05)。 結(jié)論1.通過夾閉雙頸總動脈導(dǎo)致昆明小鼠前腦缺血20min，可引起明顯的海馬組織損傷，主要表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級升高，神經(jīng)元密度降低，而補(bǔ)陽還五湯對小鼠腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷具有明顯的對抗作用。 2.補(bǔ)陽還五湯能夠明顯提高缺血腦組織SOD活性，并降低MDA含量，從而增強(qiáng)腦組織抗氧化應(yīng)激能力，減輕氧自由基損傷；同時，補(bǔ)陽還五湯能

16、夠明顯增強(qiáng)腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)抗凋亡因子bcl-2蛋白表達(dá)，降低促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)bcl-2/Bax比例，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷。這可能是本方抗腦缺血損傷的重要機(jī)制。 3.以6min腦缺血作為預(yù)處理(CIP)，可對間隔2d后20min腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，證實(shí)腦缺血耐受現(xiàn)象在昆明小鼠前腦缺血模型中同樣存在。但是6min預(yù)缺血的腦保護(hù)作用是有限的，補(bǔ)陽還五湯能夠?qū)?/p>